離子交換層析（Ion Exchange Chromatography 簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換層析是目前生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。
1. 離子交換層析的基本原理：
離子交換層析是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換層析介質(zhì)中可交換離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法，也可以認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子中帶電的氨基酸與帶相反電荷的介質(zhì)的骨架相互作用而達(dá)到分離純化的方法。
離子交換層析法主要依賴電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進(jìn)行分離，具有較高的分離容量。幾乎所有的生物大分子都是極性的，都可使其帶電，所以離子交換層析法已廣泛用于生物大分子的分離、中等純化及精制的各個(gè)步驟中。
由于離子交換層析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域成為獨(dú)立的操作單元，也已成為蛋白質(zhì)、多肽、核酸及大部分發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要的方法。目前，在生化分離中約有75%的工藝采用離子交換層析法。
2. 離子交換層析介質(zhì)：
離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。在一定條件下，溶液中的某種離子基團(tuán)可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團(tuán)結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進(jìn)入流動(dòng)相，這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對(duì)溶液中不同的離子基團(tuán)進(jìn)行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。
陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負(fù)電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團(tuán)、負(fù)電基團(tuán)和中性基團(tuán)。加樣后，負(fù)電基團(tuán)可以與平衡離子進(jìn)行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團(tuán)和中性基團(tuán)則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動(dòng)相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強(qiáng)度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負(fù)電基團(tuán)進(jìn)行交換，而將各種負(fù)電基團(tuán)置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負(fù)電基團(tuán)先被置換出來，而與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的需要較高的離子強(qiáng)度才能被置換出來，這樣各種負(fù)電基團(tuán)就會(huì)按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。
各種離子與離子交換劑上的電荷基團(tuán)的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個(gè)可逆的過程。結(jié)合的強(qiáng)度與很多因素有關(guān)，包括離子交換劑的性質(zhì)、離子本身的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強(qiáng)度、pH 等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達(dá)到分離的目的。離子交換劑的電荷基團(tuán)對(duì)不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來講，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大；價(jià)數(shù)相同時(shí)，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如陽離子交換劑對(duì)離子的結(jié)合力順序?yàn)椋?/p>
Li+ ＜ Na+ ＜ K+ ＜ Rb+ ＜ Cs+； Na+ ＜ Ca2+ ＜ Al3+ ＜ Ti4+
蛋白質(zhì)等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合與它們的性質(zhì)及pH 有較大關(guān)系。以用陽離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH 條件下，等電點(diǎn)pI < pH 的蛋白帶負(fù)電，不能與陽離子交換劑結(jié)合；等電點(diǎn)pI > pH 的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結(jié)合，一般pI 越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。但由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計(jì)，往往要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。
3. 離子交換層析介質(zhì)的種類和性質(zhì)：
3.1 離子交換劑的基質(zhì)：
離子交換劑的大分子聚合物基質(zhì)可以由多種材料制成，苯乙烯系離子交換劑是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯為基質(zhì)。苯乙烯系離子交換劑機(jī)械強(qiáng)度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強(qiáng)的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素、球狀纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強(qiáng)的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。
3.2 離子交換劑的電荷基團(tuán)：
根據(jù)與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，可以交換陽離子物質(zhì)。根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，又可以分為強(qiáng)酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區(qū)別在于它們電荷基團(tuán)解離的pH 范圍，強(qiáng)酸型離子交換劑在較大的pH 范圍內(nèi)電荷基團(tuán)解離，而弱酸型解離的pH 范圍則較小，如羧甲基在pH小于6時(shí)就失去了交換能力。一般結(jié)合磺酸基團(tuán)，如磺酸甲基、磺酸乙基等為強(qiáng)酸型離子交換劑，結(jié)合磷酸基團(tuán)和亞磷酸基團(tuán)為中等酸型離子交換劑，結(jié)合酚羥基或羧基，如羧甲基為弱酸型離子交換劑。一般來講強(qiáng)酸型離子交換劑對(duì)H 離子的結(jié)合力比Na+離子小，弱酸型離子交換劑對(duì)H 離子的結(jié)合力比Na+離子大。
陰離子交換劑的電荷基團(tuán)帶正電，可以交換陰離子物質(zhì)。同樣根據(jù)電荷基團(tuán)的解離度不同，可以分為強(qiáng)堿型、中等堿型和弱堿型三類。一般結(jié)合季胺基團(tuán)，如季胺乙基為強(qiáng)堿型離子交換劑，結(jié)合叔胺、仲胺、伯胺等為中等或弱堿型離子交換劑，如結(jié)合二乙基氨基乙基為弱堿型離子交換劑。一般來講強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì)OH-離子的結(jié)合力比Cl-離子小，弱酸型離子交換劑對(duì)OH-離子的結(jié)合力比Cl-離子大。
3.3 交換容量：
交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中關(guān)心的是層析柱與樣品中各個(gè)待分離組分進(jìn)行交換時(shí)的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實(shí)驗(yàn)條件有很大的關(guān)系，一般又稱為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經(jīng)說明都是指有效交換容量。
影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個(gè)方面，一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當(dāng)然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量能夠讓樣品組分進(jìn)入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因?yàn)樾》肿涌梢宰杂傻倪M(jìn)入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對(duì)于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因?yàn)閷?duì)于很大的分子，一般不能進(jìn)入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。
另一些影響因素如實(shí)驗(yàn)中的離子強(qiáng)度、pH 值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般pH 對(duì)弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對(duì)于弱酸型離子交換劑在pH 較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH 時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小。同時(shí)pH 也影響樣品組分的帶電性。尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在離子交換層析中要選擇合適的pH 以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結(jié)合。一般來說，離子強(qiáng)度增大，交換容量下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)（mmol/g或mmol/mL）來表示。通?？梢杂傻味ǚy定。陽離子交換劑首先用HCl 處理，使其平衡離子為H+。再用水洗至中性，對(duì)于強(qiáng)酸型離子交換劑，用NaCl 充分置換出H+，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的NaOH 滴定生成的HCl，就可以計(jì)算出離子交換劑的交換容量；對(duì)于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H+充分置換出來，再用酸滴定，計(jì)算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測定。
對(duì)于一些常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質(zhì)的量來表示，一般這種表示方法對(duì)于分離蛋白質(zhì)等生物大分子具有更大的參考價(jià)值。實(shí)驗(yàn)前可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。
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