小鼠含免疫球蛋白樣環(huán)和上皮生長因子樣域酪氨酸激酶2（Tie-2）ELISA Kit

標本的采集及保存 ：
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?span lang="EN-US">-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?span lang="EN-US">-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?span lang="EN-US">-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 mU/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋200 mU/ml，100 mU/ml，50 mU/ml，25 mU/ml，12.5 mU/ml，6.25 mU/ml，3.12 mU/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 mU/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制100 mU/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）200 mU/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟：
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?span lang="EN-US">100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
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