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實(shí)驗(yàn)材料

?BSA（1 mg/ml），0.05 g的BSA(Sigma-Aldrich Ltd.)溶于50ml ddH2O中，每Eppendorf管約加入1ml溶液，并在-20℃下冷凍。

?預(yù)染色marker (Bio-Rad)

?ProMarker(Wealtec)

?兩套玻璃板與校正卡，厚玻璃板與U形玻璃板，0.75 mm厚膠條和一個(gè)0.75 mm 10齒梳（Wealtec）

?濃度為12％的SDS-PAGE分離膠（0.75 mm）;2.31 ml ddH2O，2.8 ml濃度為30％的Acrylamide/Bis（29:1）(Bio-Rad)，1.75 ml的1.5M Tris-CL，pH 8.8(Sigma-Aldrich Ltd.)，70 μl濃度為10％的SDS(Bio-Rad)，70 μl 10 ％APS(Bio-Rad)，2.8μl TEMED(Bio-Rad)

?5％SDS-PAGE濃縮膠（0.75 mm）; 1.7 ml ddH 2 O，0.415 ml 濃度為30％的Acrylamide/Bis（29:1）（Bio-Rad），0.315 ml的1M Tris-CL，pH值為6.8（Sigma），25 μl濃度為10％的SDS（Bio-Rad），25 μl濃度為10 ％的APS（Bio-Rad），2.5 μl的TEMED（Bio-Rad）

?10X Tris-Glycine緩沖液（Sigma）

?V-GES灌膠模具（Wealtec）

?V-GES電極與電泳槽（Wealtec）

?制冷恒溫金屬浴（Wealtec）

?恒溫金屬?。╓ealtec）

?膠鏟（Wealtec）

?考馬斯藍(lán)染色緩沖液（濃度為0.1％的考馬斯亮藍(lán) R-250（Bio-Rad）溶于水/甲醇/乙酸（比例: 45:45:10）混合液中）

?脫色緩沖液（水/甲醇/乙酸（比例:45:45:10））

?配有紫外/白光轉(zhuǎn)換板的Dolphin Doc凝膠成像系統(tǒng)（Wealtec)

步驟

灌膠并將膠塊置入電極中：

?灌膠之前，用75％的乙醇擦試玻璃板和膠條。向上抬起翼型扳手打開(kāi)灌膠模具，并將模塊水平放置到臺(tái)面。將玻璃板和膠條按順序放入V-GES灌膠模具中（圖 2）。

?記得將校正卡恰當(dāng)?shù)夭迦牒癫ＡО迮cU形玻璃板之間的空隙，以確保膠條插入位置準(zhǔn)確。合攏灌膠模具后并直立放置，雙手均勻用力向下扣住翼型扳手以關(guān)閉灌膠模具。若位置正確，校準(zhǔn)卡應(yīng)該可以正常上下抽拉活動(dòng)而不被夾在膠條與玻璃板之間。（圖3- 5）

?用5 ml分離膠溶液（圖 6）制備濃度為12％的SDS-PAGE凝膠，然后用移液管將1 ml乙醇滴入裝好的灌膠模具中。等候60分鐘使凝膠聚合。當(dāng)把溶液倒入玻璃板夾層之間時(shí)，將移液管嘴直接置于玻璃板之間，緩慢地滴出液體，盡量避免形成氣泡。凝膠完成聚合后，移除乙醇，將制備好的濃縮膠溶液倒入到分離膠上。輕輕將0.75 mm 10孔梳子插入玻璃板之間。確保無(wú)氣泡產(chǎn)生（圖 7）。讓濃縮膠聚合60分鐘。

?在900 ml蒸餾水中稀釋100 ml 10 X緩沖液，并添加SDS, 制成zui后濃度為3.5mM的 SDS-PAGE電泳緩沖液。

?將兩個(gè)翼型扳手均勻施力掰開(kāi)，從灌膠模具中取出凝膠三明治夾。通過(guò)灌膠模具背后留的兩個(gè)大孔，輕輕向上將三明治夾推出（圖 8）。

?將電極放入垂直電泳槽內(nèi)。貼著電極壁，將凝膠三明治夾垂直方向插入電極中（圖 9）。

?把凝膠三明治夾置于合適的位置后，關(guān)閉電極門（圖10）。

?如只運(yùn)行一塊凝膠，則需要把膠門（很厚的玻璃板）插入到電極空著的一邊。將SDS-PAGE電泳緩沖液倒入凝膠三明治夾與膠門之間，直到緩沖液表面距離玻璃板上緣1cm（圖 11）。檢查是否有滲漏。將1升的SDS-PAGE電泳緩沖液倒入槽內(nèi)凝膠組件的周圍。

樣品制備和裝載：

?將試管插入至制冷恒溫金屬浴（4℃），以解凍冷凍牛血清白蛋白（BSA）（1 mg/ml）樣品。 然后，加入25μl 4X蛋白染料及75 μl的已解凍牛血清白蛋白溶液。

?把樣品加樣到凝膠中前, 請(qǐng)?jiān)诤銣亟饘僭≈幸?5℃的溫度煮沸混合好的 BSA樣品、預(yù)染標(biāo)記和 ProMarker，5分鐘。

?向凝膠中裝載樣品前，用100μl的移液器輕輕抽放緩沖液沖洗井孔讓樣品孔更平滑。在把樣品放入凝膠前，做簡(jiǎn)單離心與混勻保證蛋白溶液濃度不變。在每個(gè)孔中注入10μl的蛋白質(zhì)樣品（圖 12）。

?將安全蓋安裝到槽頂部，并將電極導(dǎo)線連接至電源（圖 13）。

?開(kāi)始電泳：90 V運(yùn)行60分鐘，130V再運(yùn)行60分鐘。

?電泳后，將膠鏟插入到兩玻璃板之間，輕輕來(lái)回撬動(dòng)直到兩板分開(kāi)，把凝膠從玻璃板上移除（圖 14）。 除去上層膠，用考馬斯亮藍(lán)溶液染色下層分離膠15分鐘。

?將凝膠置于脫色緩沖液過(guò)夜震蕩進(jìn)行脫色。

?通過(guò)Dolphin-Doc凝膠成像分析系統(tǒng)的紫外/白光轉(zhuǎn)換板拍照。

結(jié)果

圖1. 電泳后的凝膠。左邊外側(cè)孔裝載預(yù)染色marker，右邊兩個(gè)外側(cè)泳道裝載Pro-marker。中間的孔裝載1 mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA)。濃縮膠部分已被除去。

備注

?在12％的分離膠中用恒定電壓輸出設(shè)置對(duì)樣品進(jìn)行分離, BSA（66.2 kDa）被地分離到相對(duì)于預(yù)染色Marker（Bio-Rad）在凝膠中的遷移的位置。

?在制作下層分離膠的同時(shí)，將溶液注入玻璃板后, 請(qǐng)使用EtOH溶液或蒸餾水將凝膠處理平整。否則，外道的蛋白質(zhì)會(huì)傾向于向一側(cè)偏斜。

?分離小體積、或者大小體積的蛋白質(zhì)/多肽時(shí)，可能需要使用不同凝膠濃度、分離時(shí)間和電壓設(shè)置。除了向蛋白質(zhì)樣品添加諸如熒光蛋白染色劑等添加劑外，混合物也可能改變蛋白質(zhì)的遷移特性。

?實(shí)驗(yàn)者在組裝玻璃板和膠條的過(guò)程中務(wù)必格外小心。若膠條放置不當(dāng)，可能導(dǎo)致漏膠。使用校準(zhǔn)卡可以更方便地找到膠條的正確位置。

?組裝好灌膠模具之后，可在倒入制膠溶液之前, 用移液管往玻璃板夾層注水, 并等待約5分鐘，以測(cè)試是否有滲漏。