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閱讀：203發(fā)布時(shí)間：2017-4-17
PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)的簡(jiǎn)稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。用于基因檢測(cè)，具有高度敏感性、特異性、快速、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，能將傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)的極少數(shù)病毒DNA片段擴(kuò)增百萬(wàn)倍以上，從而**提高疾病的診斷水平。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA，RNA的地方.又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)規(guī)劃：
1、PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局
PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為三個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。
2、實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制
PCR實(shí)驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化等級(jí)要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
(1)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對(duì)與氣流壓力的控制，本區(qū)應(yīng)對(duì)外界保持微正壓。
(2)標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。
(3)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增片段的測(cè)定。此外，已制備的DNA模板(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
3、污染的預(yù)防與控制
PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
(1)工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分
各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理;各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。
(2)合理的系統(tǒng)設(shè)置
合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。
(3)規(guī)范的操作
擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作;在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施;清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對(duì)一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。
(4)嚴(yán)格的管理
嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門;盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性;擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是zui主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過(guò)的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。
(5)完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施
完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。
疾控中心PCR實(shí)驗(yàn)室基本要求
1、PCR實(shí)驗(yàn)室依據(jù)所使用的方法可分為試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析等三或四個(gè)區(qū)域。只是使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀、HIV病毒載量測(cè)定儀的PCR實(shí)驗(yàn)室，有上述前面三個(gè)區(qū)域即可。各區(qū)域應(yīng)*獨(dú)立分隔，不應(yīng)有任何的空氣直通。
2、產(chǎn)物分析區(qū)或三個(gè)區(qū)域的zui后一個(gè)區(qū)域(即擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))，空氣流向應(yīng)由室外向室內(nèi)，可通過(guò)在室內(nèi)設(shè)置通風(fēng)櫥、排風(fēng)扇或其他排風(fēng)系統(tǒng)達(dá)到空氣流由室外向室內(nèi)流動(dòng)的要求。
3、PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域儀器設(shè)備配備通常如下：
(1)試劑準(zhǔn)備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有加樣器、冰箱、天平、低速離心機(jī)、混勻器、可移動(dòng)紫外燈等?？墒褂贸瑑艄ぷ髋_(tái)作為試劑配制操作臺(tái)面。
(2)標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有生物安全柜(為B2，可避免提取核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本間交叉“污染”，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。此外還應(yīng)配備加樣器、臺(tái)式高速離心機(jī)(冷凍及常溫)、臺(tái)式低速離心機(jī)、恒溫設(shè)備(水浴和/或干浴儀)、冰箱、混勻器和可移動(dòng)紫外燈等。
(3)擴(kuò)增區(qū)主要儀器就是核酸擴(kuò)增熱循環(huán)儀(PCR儀，實(shí)時(shí)熒光或普通的)。熱循環(huán)儀的電源應(yīng)，并配備一個(gè)穩(wěn)壓電源或UPS，以防止由于電壓的波動(dòng)對(duì)擴(kuò)增測(cè)定的影響。此外，根據(jù)工作需要，還可配備加樣器、超凈臺(tái)等。
(4)產(chǎn)物分析區(qū)：本區(qū)所使用的儀器設(shè)備可能有加樣器、電泳儀(槽)、電轉(zhuǎn)印儀、雜交爐或雜交箱、水浴箱、DNA測(cè)序儀、酶標(biāo)儀和洗板機(jī)等。
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