I. 用n-Octyl-β-D-glucoside提取大腸桿菌乳糖輸送體

1. 試劑

·從lacY recombinant大腸桿菌T206制備的膜泡

·n-Octyl-β-D-glucoside

·膽酸鈉 （Sodium cholate）

·Dithiothreitol （DTT）

·取自大腸桿菌的磷脂 （Avanti Biochem.公司）

·DEAE-Sepharose CL-6B （GE Healthcare公司）

·磷酸鉀 （Potassium Phosphate）

·乳糖 （lactose）

·尿素 （生化級(jí)）

·磷酸

2. 方法

以下操作，在沒(méi)有特指時(shí)的溫度是指4℃，用Vortex mixer攪拌。

1） 要得到約10 mg的蛋白質(zhì)，可以取外翻型膜泡 （inside-out vesicles） 12.5 mg，加入1 ml緩沖液 （50 mmol/l 磷酸鉀，pH7.5、0.5 mmol/l DTT，10 mmol/l乳糖）制成懸濁液。

2） 在室溫條件下，邊攪拌，邊滴加等量的尿素溶液（10 mmol/l）。

3） 在冰浴中放置10分鐘后，在175,000× 的速度條件下離心1小時(shí)。

4） 沉淀用1.75 ml緩沖液 （50 mmol/l磷酸鉀，pH7.5） 制成懸濁液。邊攪拌，邊加入膽酸鈉溶液 （20%w/v，pH7.8），終濃度為6%。

5） 在冰浴中放置20分鐘后，在26,000×g的速度條件下離心15分鐘。

* 以上操作是為了去除膜中不需要的蛋白質(zhì)。

6） 沉淀用5 ml緩沖液 （10 mmol/l磷酸鉀，pH5.8） 制成懸濁液，離心，重復(fù)此步驟1-2次。

7） 沉淀用1.45 ml緩沖液 （10 mmol/磷酸鉀，pH5.8） 制成懸濁液，加入17.5 l DTT溶液 （100 mmol/l），13 mg乳糖，131 l磷脂溶液 （50 mg/ml），攪拌均勻。

8） 在上述溶液中加入146 µl n-Octyl-β-D-glucoside （15% w/v，10 mmol/l磷酸鉀，pH5.8），使終濃度為1.25%，

蛋白質(zhì)/磷脂/去垢劑的比例約為1:3:10。

9） 攪拌時(shí)請(qǐng)注意不要起泡沫，在冰浴中放置10分鐘后攪拌，然后在175,000× 的速度下離心1小時(shí)。

10） 取上清，用磷酸溶液 （10 mmol/l 磷酸, 含1.25% n-Octyl-β-D-glucoside） 調(diào)節(jié)pH至5.8。

11） 用DEAE-Sepharose 純化柱純化1 ml蛋白質(zhì)提取液 （含約300 µg 蛋白質(zhì)）。

溶出液：10 mmol/l 磷酸鉀，pH5.8，1 mmol/l DTT，20 mmol/l乳糖, 0.25 mg 磷脂/ml, 1.25%（w/v） n-Octyl-β-D-glucoside

II. 用 n-Heptyl-β-D-thioglucoside提取腸炎弧菌的膜結(jié)合性 5'-核苷酸酶

1. 試劑

·采用French Pressure法制備的膜泡

·n-Heptyl-β-D-thioglucoside

·EDTA-2K

·Dithiothreitol （DTT）

·Tricine

·MOPS

·Tris

·氯化鈉

·硫酸鎂

·2-Mercaptoethanol

·DEAE-Sepharose CL-6B （GE Healthcare公司）

2. 方法

以下操作，在沒(méi)有特指時(shí)的溫度是指4℃。

1） 取腸炎弧菌的的膜泡 （含145 mg蛋白質(zhì)） 用30 ml緩沖液（3 mmol/l Tricine-Tris、pH8.0、0.5 mmol/l EDTA-2K、1 mmol/l 2-Mercaptoethanol） 制成懸濁液。在冰浴中輕輕地?cái)嚢杓s30分鐘后，105,000×g離心1小時(shí)。

2） 加入含有n-Heptyl-β-D-thioglucoside 40 mmol/l的緩沖液（20 mmol/l MOPS-Tris、pH7.5、5 mmol/l硫酸鎂、1 mmol/l DTT） 制成懸濁液，蛋白質(zhì)濃度約為1 mg/ml。在冰浴中輕輕地?fù)u勻約15分鐘。

3） 105,000×g離心1小時(shí)，得到5'-核苷酸酶的上清。

4） 用DEAE-Sepharose 純化柱純化上清。溶出液：50 mmol/l MOPS-Tris、pH 8.0、5 mmol/l硫酸鎂、1 mmol/l DTT、40 mmol/l n-Heptyl-β-D-thioglucoside、100→400 mmol/l （梯度）氯化鈉

III. 用CHAPS提取巨噬細(xì)胞的細(xì)胞骨架

1．試劑

·S.typhimurium LPS （Difco公司）

·胎牛血清 （FBS）

·肝素 （heparin）

·Dulbecco's MEM （DMEM）

·Plasticcoverslip （SUMITOMO BAKELITE 公司、celldesk）

·PIPES

·HEPES

·GEDTA

·Phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA、Sigma公司）

·氯化鎂

·CHAPS （在硅膠干燥器中干燥約2周后使用）

2. 方法

1） 用滅菌蒸餾水將 S.typhimurium LPS配制成200 µg/ml。給小鼠 （SLC-ICR、7-10周齡） 腹腔注射，劑量為0.25 ml/只。

2） 5-6天后，用10 mmol/l HEPES（添加10% FBS、10 U/ml肝素、含DMEM pH7.1）洗凈腹腔，收集細(xì)胞。

3） 用4℃的DMEM將貼壁的腹腔細(xì)胞離心洗凈3次 （1,000 rpm，10分鐘/次）。

4） 用含有10% FBS的DMEM調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至10e6個(gè)/ml，移至培養(yǎng)皿中。

5） 在4℃的條件下，用FBS浸泡蓋玻片一個(gè)晚上，然后用DMEM洗凈10分鐘，將蓋玻片放入上述培養(yǎng)皿中。在CO₂培養(yǎng)箱中37℃下孵育20分鐘 （每一張蓋玻片需要細(xì)胞液1 ml）。

6） 將蓋玻片一張一張放入4℃含有DMEM的培養(yǎng)皿中，用巴氏吸管吸掉非貼壁細(xì)胞。

7） 在含有10% FBS的DMEM中加入稀釋的PMA，在CO₂培養(yǎng)箱中37℃下孵育20分鐘。

8） 用室溫DMEM將貼付著細(xì)胞的蓋玻片洗凈10分鐘。

9） 用室溫的PHEM 緩沖液 （60 mmol/l PIPES、25 mmol/l HEPES、10 mmol/l GEDTA、2 mmol/l氯化鎂、pH6.9）

清洗2次 （10分鐘/次）。

10） 預(yù)先將蓋玻片放置在37℃的PHEM緩沖液中約5分鐘。

11） 用PHEM緩沖液配制0.5%CHAPS溶液^*2,^*3，取15 ml加入^*4直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，將蓋子反過(guò)來(lái)蓋在培養(yǎng)皿上，放置在37℃培養(yǎng)箱中。

將貼付著細(xì)胞的蓋玻片放在如上的培養(yǎng)皿中（2張蓋玻片/1個(gè)培養(yǎng)皿），放置3分鐘后會(huì)露出細(xì)胞骨架，這時(shí)輕輕振搖培養(yǎng)皿45-60秒。

12） 用37℃的PHEM 緩沖液洗凈3次（分別為2-3分鐘，10分鐘，10分鐘），清洗后放回到室溫的PHEM 緩沖液里，細(xì)胞骨架樣品制備完成。

*1 清洗不足的話(huà)，會(huì)降低細(xì)胞骨架露出率。

*2 CHAPS溶液要在使用前1小時(shí)內(nèi)配制，混合時(shí)注意不要產(chǎn)生泡沫。CHAPS的濃度一定要準(zhǔn)確地配制成0.5% （8.132 mmol/l ）。如果濃度過(guò)高，會(huì)增加從蓋玻片上掉落的細(xì)胞，一部分的細(xì)胞骨架會(huì)溶解下來(lái)。如果濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的溶解效果差。

*3 CHAPS的溶液量，1個(gè)直徑13.5 mm的培養(yǎng)皿需要6 ml以上。

*4 請(qǐng)注意振搖過(guò)強(qiáng)的話(huà)，會(huì)增加細(xì)胞脫落。

IV. 用CHAPS從原生質(zhì)體分離液胞

1. 試劑

·從Atriplex gmelini的綠葉中制得的原生質(zhì)體 （1.2 mol/l山梨糖醇中分離）

·CHAPS

·GEDTA （EGTA）

·HEPES

·山梨糖醇

·Tris

2．方法

1） 取1 ml 原生質(zhì)體放入巴氏瓶中^*1。

2） 加入50 ml緩沖液 （1.0 mol/l山梨糖醇、1 mmol/l GEDTA、0.5 mmol/l CHAPS、20 mmol/l HEPES-Tris、pH8.0）。120×g離心3分鐘。

3） 收集上清液中的液胞 （約1.2 ml）^*2，放入巴氏瓶中。

4） 用緩沖液 （1.0 mol/l 山梨糖醇、20 mmol/l HEPES-Tris、pH8.0） 稀釋19倍。120×g離心3分鐘, 回收上清液中懸浮的液胞。

*1 用0.5 mol/l 山梨糖醇分離原生質(zhì)體時(shí)，添加10% Ficoll 400等，使原生質(zhì)體懸浮。

*2 原生質(zhì)體的上清液不濃縮的話(huà)， 使用Ficoll 400等，需要提高溶液的比重。