活性氧檢測試劑盒

使用說明書

活性氧檢測試劑盒操作步驟：

一、試劑準備：

1. dcfh-da可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響dcfh-da及細胞內(nèi)熒光產(chǎn)生，但可能會影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀熒光測定。可將dcfh-da稀釋于無酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如pbs中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進行測定。

2. 加入dcfh-da的時機或孵育時間，以zui終能順利檢測細胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時間較短(<2小時)或預(yù)計ros效應(yīng)較弱，可先加或同時加入dcfh-da。反之，treat 刺激時間較長(>6 小時)或預(yù)計產(chǎn)生ros效應(yīng)較強，可后加dcfh-da。

3. 活性氧供體含高純度12 mm h2o2。加入細胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產(chǎn)生其它類型的活性氧，均可使dcfh-da氧化為dcf呈現(xiàn)強綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測試實驗系統(tǒng)或儀器的陽性試劑，以初步觀察細胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征，并且也可以將該實際作為實驗的一個陽性對照。*該試劑的細胞工作濃度為20~100 μm或更低濃度，但超過200μm將產(chǎn)生細胞毒。如果用戶熟悉ros熒光或?qū)嶒灈]有必要采用陽性對照，可以不加該試劑。

二、加入熒光探針：

1. 加入dcfh-da于培養(yǎng)基，*初始工作濃度為10 μm。對不同的細胞和處理，dcfh-da工作濃度可為100 nm~20 μm，需進行預(yù)實驗確定合適的濃度?？傮w稀釋倍數(shù)應(yīng)在1:500~1000以上以避免dmso對細胞的影響。以dmso作為溶劑對照。

2. 37 oc 孵育細胞30min~至幾個小時，通常30-60min 即可。孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、dcfh-da濃度有關(guān)。

3. pbs洗滌細胞2次。

三、活性氧檢測試劑盒熒光檢測

采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測照相，綠色熒光強度代表活性氧水平。也可進行微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實時或每10分鐘分時逐點檢測熒光強弱。對于流式細胞儀可將細胞

用*消化pbs洗滌后重懸檢測。