三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中*侵襲性的一種，由于不表達(dá)激素受體以及HER2，無(wú)法使用靶向治療，長(zhǎng)期以來(lái)TNBC患者只能接受手術(shù)以及放化療

免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法的出現(xiàn)為TNBC患者帶來(lái)了新的希望，然而臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑聯(lián)合化療僅能使一小部分TNBC患者獲益[1,2]。因此，探究TNBC對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療耐藥的機(jī)制至關(guān)重要，這將為改善免疫治療效果提供參考。

近期，由Dana-Farber癌癥中心Judith Agudo教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在Cell期刊發(fā)表重要研究成果[3]，他們發(fā)現(xiàn)在TNBC中有一群抵抗T細(xì)胞殺傷的靜息腫瘤細(xì)胞（QCCs）。這些QCCs通過(guò)激活HIF1a，與免疫抑制性成纖維細(xì)胞、功能失調(diào)的DC細(xì)胞一起形成了一個(gè)抵御T細(xì)胞浸潤(rùn)與殺傷的微環(huán)境。從而在免疫治療中存活下來(lái)并引起腫瘤復(fù)發(fā)。

這項(xiàng)研究成果為我們揭開了乳腺癌免疫逃逸的神秘面紗，突出了QCCs在乳腺癌免疫逃逸中的重要作用，提示我們靶向清除QCCs可能是破解TNBC免疫耐藥難題的有效途徑。

以往有研究發(fā)現(xiàn)一些基因在腫瘤細(xì)胞抵抗免疫治療中具有一定作用[4,5]，但是這些研究并不能解釋腫瘤細(xì)胞是如何營(yíng)造出一個(gè)免疫抑制性微環(huán)境的；此外，通過(guò)測(cè)序的手段能夠找到對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療耐藥腫瘤所具備的一些特征，但是腫瘤組織中存在大量異質(zhì)性的細(xì)胞群體，這大大增加了尋找腫瘤耐藥機(jī)制的難度。例如丟失腫瘤抗原的癌細(xì)胞與腫瘤抗原陽(yáng)性的癌細(xì)胞在逃脫免疫系統(tǒng)追殺過(guò)程中采取的方法顯然是不同的。

在這項(xiàng)研究中，Agudo教授團(tuán)隊(duì)希望探究那些表達(dá)腫瘤抗原的癌細(xì)胞是怎么逃脫免疫系統(tǒng)的追殺的。因此，他們?yōu)樾∈蠼臃N了表達(dá)GFP或mCherry的TNBC細(xì)胞系4T07，并為小鼠轉(zhuǎn)輸特異性識(shí)別GFP的PD-1-/-Jedi T細(xì)胞(敲除PD-1是為了模擬PD-1抑制劑治療)。由于Jedi T細(xì)胞的TCR只能特異性識(shí)別GFP而不能識(shí)別mCherry。因此該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂脕?lái)探究持續(xù)表達(dá)腫瘤特異性抗原的腫瘤細(xì)胞(GFP+腫瘤細(xì)胞)是如何逃脫腫瘤抗原特異性T細(xì)胞(Jedi T細(xì)胞)的攻擊。

研究團(tuán)隊(duì)在轉(zhuǎn)輸Jedi T細(xì)胞后第5天分析腫瘤內(nèi)GFP+與mCherry+腫瘤細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)Jedi T細(xì)胞殺死了大部分GFP+腫瘤細(xì)胞，但是仍然有一部分GFP+腫瘤細(xì)胞逃脫了T細(xì)胞的殺傷。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)這些逃脫殺傷的GFP+腫瘤細(xì)胞形成了一個(gè)細(xì)胞簇，在細(xì)胞簇內(nèi)部T細(xì)胞浸潤(rùn)水平降低了兩倍。這說(shuō)明幸存的GFP+腫瘤細(xì)胞簇能夠阻止T細(xì)胞的浸潤(rùn)，這可能是導(dǎo)致其對(duì)免疫治療產(chǎn)生抵抗的原因之一。

Jedi T細(xì)胞攻擊后存活的GFP+腫瘤細(xì)胞聚集成簇

接下來(lái)，Agudo教授團(tuán)隊(duì)分析了幸存的GFP+腫瘤細(xì)胞與對(duì)照mCherry+腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異。他們發(fā)現(xiàn)，與mCherry+腫瘤細(xì)胞相比，GFP+腫瘤細(xì)胞中與細(xì)胞周期相關(guān)的基因明顯下調(diào)。EdU（胸腺嘧啶核苷類似物5-乙炔-20-脫氧尿苷）摻入實(shí)驗(yàn)表明這些在Jedi T細(xì)胞攻擊后存活的GFP+腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期停滯狀態(tài)（稱為靜息腫瘤細(xì)胞，QCCs）。

那么這些QCCs是否對(duì)T細(xì)胞的殺傷更具抗性呢？研究團(tuán)隊(duì)向腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)入tdTomato-p27K，這可以使QCCs被tdTomato標(biāo)記。向荷瘤小鼠轉(zhuǎn)輸PD-1-/- Jedi T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照非免疫原性miRFP670+腫瘤細(xì)胞，存活下來(lái)的GFP+腫瘤細(xì)胞大部分都是tdTomato+的，這說(shuō)明QCCs對(duì)T細(xì)胞的殺傷具有更強(qiáng)的抵抗能力。

在Jedi T細(xì)胞攻擊中存活下來(lái)的GFP+腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期靜息狀態(tài)，并對(duì)T細(xì)胞的殺傷具有更強(qiáng)的抵抗力

以上的結(jié)果表明在小鼠模型中，QCCs是免疫治療耐藥的主力，那這種現(xiàn)象在人類患者中是否也存在呢？通過(guò)分析乳腺癌患者組織病理樣本以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究院隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中與T細(xì)胞接觸的腫瘤細(xì)胞大多是Ki67+的增殖細(xì)胞，p27+的QCCs極少與T細(xì)胞接觸；同時(shí)基因集富集分析表明，與治療無(wú)應(yīng)答者相比，免疫治療應(yīng)答患者的腫瘤細(xì)胞在DNA復(fù)制相關(guān)通路更加富集，表明它們處于非靜止?fàn)顟B(tài)。這種相關(guān)性提示我們，QCCs可能與乳腺癌患者免疫治療效果不佳有關(guān)。

乳腺癌患者腫瘤組織中靜息腫瘤細(xì)胞周圍T細(xì)胞浸潤(rùn)較少，并且對(duì)免疫治療有應(yīng)答的患者其腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期活躍狀態(tài)

為了探究QCCs的耐藥機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)QCCs以及非靜止腫瘤細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序。數(shù)據(jù)分析表明，QCCs上調(diào)了缺氧以及葡萄糖代謝相關(guān)通路基因。免疫熒光染色結(jié)果顯示，p27K+QCCs與缺氧探針共定位，而T細(xì)胞則很少浸潤(rùn)至缺氧區(qū)域；Jedi T細(xì)胞治療后幸存的GFP+腫瘤細(xì)胞也位于低氧區(qū)域中。這些數(shù)據(jù)表明乳腺癌中的QCCs主要位于T細(xì)胞浸潤(rùn)較少的缺氧微環(huán)境中。

QCCs所在區(qū)域處于明顯的低氧狀態(tài)，并且T細(xì)胞浸潤(rùn)較少

接下來(lái)，為了在單細(xì)胞水平上分析QCCs抑制T細(xì)胞功能的機(jī)制，Agudo教授團(tuán)隊(duì)分離了QCCs細(xì)胞簇內(nèi)外的浸潤(rùn)細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部存在大量免疫抑制性成纖維細(xì)胞，這解釋了為何QCCs區(qū)域浸潤(rùn)T細(xì)胞數(shù)目較少。

對(duì)QCCs細(xì)胞簇內(nèi)外浸潤(rùn)T細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)在缺氧的QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部的CD8+ T細(xì)胞耗竭程度更深，殺傷能力更弱。

QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部存在大量免疫抑制性成纖維細(xì)胞，浸潤(rùn)的T細(xì)胞數(shù)量顯著低于QCCs細(xì)胞簇外，并且QCCs細(xì)胞簇內(nèi)浸潤(rùn)的T細(xì)胞耗竭程度更高

究竟是哪群細(xì)胞促進(jìn)了T細(xì)胞的功能失調(diào)呢？通過(guò)對(duì)QCCs內(nèi)部浸潤(rùn)各細(xì)胞亞群進(jìn)行缺氧特征評(píng)分，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞表達(dá)豐富的缺氧相關(guān)基因，并且下調(diào)促進(jìn)T細(xì)胞活化的基因，如MHCⅠ與MHCⅡ、IL-12、CD80/86，表明這些DC細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞活化的能力極大地減弱了，這可能是QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部浸潤(rùn)的T細(xì)胞功能失調(diào)的重要原因。

但是Agudo教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氧并不能直接削弱DC細(xì)胞活化T細(xì)胞的能力，所以研究團(tuán)隊(duì)將目光轉(zhuǎn)向QCCs本身。探究是否是表達(dá)HIF1a的QCCs塑造了免疫抑制性的微環(huán)境，損傷DC細(xì)胞活化T細(xì)胞的能力進(jìn)而抑制了T細(xì)胞免疫應(yīng)答。為此，他們構(gòu)建了表達(dá)活化型HIF1a(HIF1aSTBL)的乳腺癌細(xì)胞系。

荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示，相比于WT腫瘤，表達(dá)HIF1aSTBL的腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的T細(xì)胞數(shù)量更少，耗竭程度更深；瘤內(nèi)DC細(xì)胞上MHCⅡ表達(dá)明顯下調(diào)，這些現(xiàn)象與在QCCs細(xì)胞簇內(nèi)部觀察到的基本一致。

更進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊(duì)將WT或表達(dá)HIF1aSTBL的GFP+腫瘤細(xì)胞與mCherry+腫瘤細(xì)胞混合接種至小鼠皮下。發(fā)現(xiàn)相比于mCherry+: GFP+腫瘤組，接種了mCherry+: GFP+ HIF1aSTBL腫瘤細(xì)胞的小鼠瘤內(nèi)浸潤(rùn)T細(xì)胞數(shù)量更少，并且T細(xì)胞更難接近GFP+腫瘤細(xì)胞，存活的GFP+腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增加了數(shù)倍，可見HIF1a能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)HIF1aSTBL后能夠抑制T細(xì)胞的浸潤(rùn)并逃脫T細(xì)胞的攻擊

綜合以上數(shù)據(jù)可見，QCCs正是通過(guò)高表達(dá)HIF1a從而來(lái)營(yíng)造一個(gè)免疫抑制性的微環(huán)境，逃脫腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的追殺。那么敲除腫瘤細(xì)胞中的HIF1a是否就能夠促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷呢？實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲除腫瘤細(xì)胞中的HIF1a后，腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)T細(xì)胞數(shù)量顯著增加并且耗竭程度降低，腫瘤體積明顯減小。這提示我們靶向腫瘤內(nèi)HIF1a能夠促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

敲除腫瘤細(xì)胞中的HIF1a顯著增強(qiáng)了抗腫瘤免疫應(yīng)答

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究揭示了腫瘤抗原陽(yáng)性的癌細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制：它們聚集成團(tuán)，召喚成纖維細(xì)胞為它們筑起屏障；一起進(jìn)入靜息狀態(tài)并高表達(dá)HIF1a，使得免疫系統(tǒng)的哨兵——DC細(xì)胞功能失調(diào)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些努力使得它們得以逃脫T細(xì)胞的追殺，并在免疫治療后卷土重來(lái)。