來自暨南大學理工學院，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所的研究人員針對乳腺癌位點：rs4784227（C>T）, rs1219648（G>A）和 rs3803662（T>C），利用一種簡單方法，獲得三個位點的分型結(jié)果，建立了單管多重PCR同時檢測這些位點的新檢測方法。這一研究成果公布在《中國科學—生命科學》（Scientia Sinica Vitae）雜志上。
乳腺癌是女性zui常見的惡性腫瘤之一。已有研究表明, 易感基因 FGFR2（fibroblast growth factor receptor 2）和 TNRC9（the trinucleotide repeat containing 9）的變異對 ER+（estrogen receptor-positive）乳腺癌的影響明顯。TNRC9基因上的 rs4784227（C>T）多態(tài)是基于中國女性篩選出的易感位點，rs1219648（G>A）和rs3803662（T>C）分別為 FGFR2與 TNRC9基因的主要研究對象，是導致中國女性乳腺癌惡性程度加深的遺傳因子。因此針對這3個位點建立多重檢測方法具有臨床應用價值，可作為乳腺癌高危人群預防和早期治療的參考依據(jù)。
在近年來出現(xiàn)的多種單核苷酸多態(tài)性SNP檢測技術(shù)中，四引物擴增受阻突變體系 PCR（tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, T-ARMS-PCR）或兩對交叉引物 PCR（PCR with confronting two-pair primers, PCR-CTPP）因其操作簡便、分型快速、費用低廉而被廣泛應用。
這種方法的原理為針對已知的突變, 在突變點的兩側(cè)分別設計一對外引物和一對特異性內(nèi)引物, 特異性內(nèi)引物用來檢測突變是否發(fā)生, 外引物在PCR 反應中和特異性內(nèi)引物配對, 從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。特異性內(nèi)引物的設計保證了在同一次擴增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴增片段長度不同, 因此可以通過產(chǎn)物電泳圖譜中特定條帶的有無判別個體的基因。
但是目前T-ARMS-PCR方法仍以單重檢測為主, 少數(shù)實驗室也能實現(xiàn)多重檢測（Multiplex-T-ARMS-PCR, M-T-ARMS-PCR）, 但其可同時檢測的位點數(shù)量難以進一步提高, 主要受到兩個限制——多重擴增的偏向性及瓊脂糖電泳的分辨率。
在這篇文章中，研究人員通過引入多重嵌合引物PCR技術(shù)對T-ARMS-PCR進行了改進, 在擴增初期使用特異性嵌合引物（即在特異性引物 5′端引入通用序列）擴增, 而擴增末期由通用引物引發(fā)擴增, 從而在保證反應特異性的同時, 降低了多重PCR 的偏向性。
此外, 研究人員還應用分辨率較高的毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）替代瓊脂糖電泳, 建立了單管多重 PCR 同時檢測乳腺癌相關(guān)位點rs4784227 （C>T）, rs1219648（G>A）和 rs3803662（T>C）的三位點檢測方法。
采用T-ARMS-PCR 方法進行SNP分型, 僅需一次PCR擴增和一次瓊脂糖電泳即可達到目的。這項研究采用嵌合引物擴增和毛細管電泳對T-ARMS-PCR進行改進, 建立了一種M-T-ARMS-PCR的SNP分型方法。
并且這項研究也在成功對全血樣品進行分型的基礎上，通過進一步優(yōu)化實驗條件實現(xiàn)了對濃度更低的口腔拭子樣本的準確分型。在18份口腔拭子DNA標本通過實驗全部實現(xiàn)了準確判別。由此可見, 這一方法可以應用于臨床, 可以在口腔拭子等非常少量 DNA 的基礎上, 同時獲得多個位點的分型結(jié)果, 是一種準確的SNP分型方法, 有很好的應用前
