總RNA提取可以：（）獲得高純度、高質(zhì)量的總RNA；（2）可以滿足生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)NorthernBlot、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。
實(shí)驗(yàn)方法原理 總RNA 提取試劑盒，可以用來(lái)制備高質(zhì)量的可用于建庫(kù)的RNA 。該總RNA 純化系統(tǒng)采用兩種的RNA酶抑制劑，異硫氰酸弧（GTC）和β-巰基乙醇，加上整個(gè)操作都在冰浴下進(jìn)行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA 與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA ，則根據(jù)Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，而RNA 中如含無(wú)機(jī)鹽，則有可能對(duì)以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。
實(shí)驗(yàn)材料 微生物 動(dòng)物細(xì)胞 植物組織
試劑、試劑盒 RNA 提取試劑盒 焦碳酸二乙酯 乙醇
儀器、耗材 恒溫水浴 冷凍高速離心機(jī) 紫外分光光度計(jì) 取液器 電泳儀 電泳槽
 

實(shí)驗(yàn)步驟 一、細(xì)胞或組織破碎

. 微生物材料

（）發(fā)酵3-4天（或?qū)?shù)生）的菌體，離心收集菌絲體（動(dòng)植物材料無(wú)需此步處理）。

（2）用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2-3次，并盡量除去殘存的水。

（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。

（4）研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至2 ml變性液的容器中勻漿。

2. 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料 （適用的樣品量為細(xì)胞：08）

（）細(xì)胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進(jìn)行。

（2）深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎。

①細(xì)胞收集：含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無(wú)菌離心管中，4℃，3 000 g離心5分鐘。

②細(xì)胞洗滌：上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3 000 g離心5分鐘。

③細(xì)胞破碎：在沉淀細(xì)胞中加入5 ml預(yù)冷的變性液，用無(wú)菌處理過(guò)的勻漿器勻漿。

3. 表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎

（）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)08。

（2）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8 ml預(yù)冷變性液，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時(shí)可見(jiàn)粘度加大。

（3）用無(wú)菌吸管將*個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細(xì)胞，再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶，以此類推，直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從*個(gè)培養(yǎng)瓶開(kāi)始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。

（4）將上述2 ml含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無(wú)菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。

3. 植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05 g組織）

（）將600 ul變性液置于.5 ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）將0.05 g新鮮組織用液氮冰凍。

（3）在液氮下，研磨組織塊。

（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中。

4. 動(dòng)物組織破碎 （適用的樣品量為 g 組織）

（）將2 ml變性液置于50 ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）在上述管中加入 g新鮮或冰凍動(dòng)物組織，勻漿粉碎。

二、RNA 的抽提

（） 在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600 ul＋60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉*混勻，可用漩渦振蕩器。

（2）600 ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\），*混勻或漩渦振蕩器振蕩0秒。

（3）冰裕中0-5分鐘，離心，4℃，0 000 g，20分鐘。

（4）上層水相吸至無(wú)菌離心管中+等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。

（5）離心4℃，0 000g，20分鐘。

（6）沉淀RNA ，冷凍干燥5分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul變性液中，可振蕩（有時(shí)為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時(shí)間應(yīng)極短）。

（7） 60 ul pH4.0的2M乙酸鈉*混勻，可用漩渦振蕩器。

（8） 600 ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\），*混勻或漩渦振蕩器振蕩0秒。

（9） 冰裕中0-5分鐘，離心，4℃，0 000 g，20分鐘。

（0）上層水相吸至無(wú)菌離心管中。

（） 等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥，復(fù)溶于去RNA 酶的水中（對(duì)于準(zhǔn)備保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再加入2.5體積的乙醇，-70℃保存。）。