臨床前實(shí)驗(yàn)對試劑的特異性、敏感性等指標(biāo)進(jìn)行了評價(jià)，雖然臨床前的樣品有一定的代表性，但其樣品是經(jīng)過選擇的，其量畢竟有限，并不能*代表實(shí)際應(yīng)用中樣品的情況，因此，在試劑注冊以前，必須進(jìn)行臨床評價(jià)。通過臨床評價(jià)，可以預(yù)測試劑在實(shí)際應(yīng)用中可能遇到的問題，以便在試劑說明書中提醒用戶注意，而且通過臨床評價(jià)也可以對臨床前所制定的各項(xiàng)指標(biāo)(如試劑的臨界值等)進(jìn)行修正。
一、臨床研究單位
臨床評價(jià)應(yīng)至少在三個省級以上單位進(jìn)行，而且這三個單位應(yīng)代表被檢測物的不同流行區(qū)域，分別為被檢測物的高、中、低的流行區(qū)。如果試劑所用的儀器為常用儀器，三個臨床單位使用不同品牌或不同型號的儀器。在實(shí)施臨床考核以前，組織者應(yīng)對將實(shí)施l臨床考核單位的檢測能力、所用儀器設(shè)備、人員的熟練操作能力進(jìn)行評價(jià)，而且這種評價(jià)應(yīng)在盲法的情況下進(jìn)行。組織者應(yīng)向各考核單位提供同樣的盲樣，如果評價(jià)的試劑為定性試劑，盲樣應(yīng)包括評價(jià)試劑特異性、敏感性和性的樣品；如果評價(jià)試劑為定量試劑，除包括以上樣品外，還應(yīng)包括線性和量值樣品。所有參與考核單位應(yīng)將檢測樣品的原始數(shù)據(jù)提供給組織者，組織者對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，符合要求者方能參與臨床考核。
二、對照試劑以及對照方法的選擇
目前需要評價(jià)的診斷試劑主要分為兩類，一類是*新的診斷試劑，臨床上還沒有同類試劑，對這類試劑的評價(jià)相對比較困難，其檢測的準(zhǔn)確與否主要通過分析與臨床診斷的符合情況而進(jìn)行判斷，因此，對這類試劑進(jìn)行I臨床研究所用的對照方法主要是通過觀察臨床癥狀以及實(shí)驗(yàn)室的相應(yīng)檢測，根據(jù)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行診斷，分析試劑檢測結(jié)果與臨床診斷的相關(guān)性。對一些結(jié)果不一致的患者還可以對其進(jìn)行追蹤隨訪，了解其疾病的進(jìn)程以及預(yù)后，比較zui終的相關(guān)性。而且對某些被測物來講，已有相關(guān)的診斷試劑而沒有相同的試劑，也可以用相關(guān)的診斷試劑進(jìn)行分析和比較。另一類試劑是已有同類產(chǎn)品的試劑，或者是*仿制已有的產(chǎn)品，或者是對已上市產(chǎn)品進(jìn)行了原材料、工藝、反應(yīng)程序等改進(jìn)，甚至于改變了試劑的反應(yīng)原理，但被測物是相同的。對這類試劑的評價(jià)，可采用已上市的同類產(chǎn)品。但同類產(chǎn)品可能很多，如何選擇參比試劑以及選擇的參比試劑是否合適，對zui終的研究結(jié)果具有一定的影響作用。所用的參比試劑應(yīng)該是在醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛接受的、產(chǎn)生結(jié)果zui為準(zhǔn)確的試劑，即其檢測結(jié)果與患者的實(shí)際狀態(tài)高度一致。但在實(shí)際選擇時(shí)應(yīng)該注意，并不是用的實(shí)驗(yàn)室越多以及用的時(shí)間越長的試劑，其檢測結(jié)果zui為準(zhǔn)確。而且對原材料、工藝、反應(yīng)程序等的改進(jìn)，或者試劑的反應(yīng)原理改變的試劑，應(yīng)該選擇未改變的相應(yīng)試劑作為參比試劑，以便更好地分析其改變以后的優(yōu)勢或不足。例如，試劑的原材料發(fā)生改變，由原來的裂解抗原改為基因工程抗原，評價(jià)時(shí)也應(yīng)該用非基因工程原料制備的試劑進(jìn)行評價(jià)，以分析其差異。
三、樣品的選擇
臨床樣品是研究診斷試劑的重要因素，樣品選擇合適與否將明顯影響試劑的評價(jià)結(jié)果，為客觀、科學(xué)地評價(jià)試劑，在選擇樣品時(shí)應(yīng)考慮以下幾個方面。①臨床評價(jià)樣品，至少大部分評價(jià)用樣品應(yīng)來自于自然人群，尚未用同類試劑進(jìn)行篩查。因?yàn)槿魏卧噭┑臋z測結(jié)果都可能有一定的不正確性，若已用此試劑進(jìn)行篩選，則其誤差已帶人樣品，會影響評價(jià)試劑的客觀性。例如，在評價(jià)某試劑的敏感性時(shí)，僅采用低敏感性試劑所篩查出來的陽性樣品；或者在評價(jià)某試劑的特異性時(shí)，僅選擇高特異性試劑所篩查出來的假陽性樣品等，都不能客觀地反映試劑的技術(shù)指標(biāo)。②要根據(jù)試劑適應(yīng)證的范圍選擇人群。例如，用于獻(xiàn)血員篩選的試劑，將主要選擇獻(xiàn)血員人群；用于臨床診斷的試劑將主要選擇臨床患者；用于健康普查的將選擇健康人群等。但試劑的適應(yīng)證往往針對多種人群，選擇人群時(shí)要盡可能地覆蓋適應(yīng)證范圍。③選擇不同地區(qū)的樣品，我國地域?qū)拸V，是一個多民族的國家，不同地區(qū)被測物流行率不同，而且不同地區(qū)被測物表型或含量等也可能不同。對微生物來講，在這方面的影響更為明顯，因?yàn)樵谖覈煌貐^(qū)，不同微生物的基因型、基因亞型、血清型都有可能不同，而且其差別可能影響試劑的檢測效果。④不同疾病時(shí)期的樣品，不同時(shí)期被測物的狀態(tài)是不同的，的樣品應(yīng)該是動態(tài)變化的系列樣品，即從樣品中沒有被測物到出現(xiàn)被測物，再到量的動態(tài)變化以及消失或長久持續(xù)下去。但在實(shí)際工作中很難獲得這類樣品，為了能反映試劑檢測疾病不同時(shí)期的被測物情況，選擇樣品時(shí)可選擇處于疾病不同時(shí)期的不同患者的樣品，其樣品將包括強(qiáng)陽性、弱陽性以及陰性等。⑤盡可能選擇新鮮樣品對試劑進(jìn)行評價(jià)。若樣品不是新鮮采集的話，應(yīng)分裝保存，盡量保證不同試劑所檢測樣品的狀態(tài)是相似的，避免再次凍融后用另一試劑檢測。
選擇合適的樣品是客觀評價(jià)試劑質(zhì)量的重要因素，不同的臨床樣品對試劑的評價(jià)結(jié)果是不同的。臨床樣品的選擇應(yīng)具有一定的代表性，否則會影響對試劑的質(zhì)量進(jìn)行正確評價(jià)。如在對注冊前的7家HIV-／2抗體快速檢測試劑進(jìn)行臨床評價(jià)時(shí)，共檢測了三類樣品，其中，HIV-抗體強(qiáng)陽性樣品300份、健康獻(xiàn)血員樣品440份，以及高危人群樣品264份(李秀華等，2006a)。結(jié)果顯示，檢測300份HIV-抗體強(qiáng)陽性樣品時(shí)均為陽性，未發(fā)現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。檢測440份健康獻(xiàn)血員樣品時(shí)，大部分試劑均檢測為陰性，只有個別試劑出現(xiàn)了假陽性的現(xiàn)象，試劑的特異性為97．7％～00％。檢測高危人群樣品時(shí)，試劑的特異性除個別試劑較低(僅為59．5％)外，大部分試劑的特異性在95％以上。但試劑的敏感性相差明顯，為77．2％～95．％(表7．)。在264份高危人群樣品中，有63份樣品為HIV抗體陽性。對陽性樣品的強(qiáng)弱進(jìn)行分析，并以S／CO值表示(表7．2)，大部分樣品的S／CO值為0．0～2．0，為中等強(qiáng)度，而且也有弱陽性和強(qiáng)陽性樣品，具有很好的代表型，因此，反映出了試劑靈敏度的差異。不同試劑的漏檢情況不同。例如，試劑和4漏檢的樣品均為弱陽性樣品，說明是由于靈敏度原因造成的漏檢；而其他試劑在不同強(qiáng)度的樣品中均存在漏檢，說明試劑不僅存在靈敏度偏低的問題，而且也可能存在試劑模式、HOOK效應(yīng)等。以上結(jié)果顯示，不同樣品對試劑質(zhì)量評價(jià)的結(jié)果是不一樣的，一個好的、有代表性的樣品庫能夠真實(shí)、客觀地反映試劑的技術(shù)指標(biāo)，而且也能通過對漏檢樣品特性的分析，了解試劑存在的缺陷，為試劑質(zhì)量的提高提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
由于樣品處理不同，此過程中的添加物和樣品的不同狀態(tài)等對試劑的檢測結(jié)果可能產(chǎn)生影響，而且試劑不僅適應(yīng)于正常人群，也適應(yīng)于一些特殊人群，尤其是某些特殊疾病的人群，因?yàn)槠浯x異常，可能會產(chǎn)生影響被測物檢測結(jié)果的代謝產(chǎn)物。因此，在試劑的臨床評價(jià)中，應(yīng)充分考慮以下特殊樣品。①樣品的狀態(tài)、樣品儲存條件、凍融次數(shù)和融血等。②樣品處理過程中的添加物，如不同抗凝劑是否影響試劑的檢測結(jié)果，尤其對PCR類試劑可能存在不同的影響。③異常代謝產(chǎn)物，如高免疫球蛋白樣品、高血紅蛋白、高脂樣品、高疸紅素樣品、陽性樣品、免疫系統(tǒng)疾病和孕婦的樣品等。④其他病毒抗原或抗體陽性樣品，抗體陽性的樣品可能對間接法檢測抗體的試劑存在一定的影響，而與被測物存在同源性的抗原可能影響抗原試劑的檢測結(jié)果。如果有些因素影響試劑的檢測結(jié)果，則應(yīng)該在試劑說明書中說明，以便引起使用者的注意，正確地解釋結(jié)果。
四、樣品數(shù)量的確定
臨床研究所用的樣品數(shù)量主要是由被測物的流行率所決定的，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本原理選擇適當(dāng)?shù)臉颖玖俊D7．對檢測不同樣本數(shù)量所獲得的檢測值與預(yù)期值的關(guān)系進(jìn)行了分析。從表中也可以看到，樣本量過小，所得到的指標(biāo)不穩(wěn)定，用以推斷總體的精密度和準(zhǔn)確度差，檢驗(yàn)的功效低，應(yīng)有的差別不能顯示出來，難以獲得正確的研究結(jié)果，結(jié)論也缺乏充分的依據(jù)。樣本量越大，參數(shù)的估計(jì)越，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果越有效，越能反映試劑在實(shí)際檢測中的技術(shù)指標(biāo)，但也會增加實(shí)際工作的困難。
除了考慮統(tǒng)計(jì)因素以外，試劑審批或評價(jià)部門也往往對臨床研究的診斷試劑規(guī)定檢測樣本的zui低數(shù)量。例如，我國規(guī)定三類試劑檢測的總樣本數(shù)至少000例，用于血液篩查試劑檢測的總樣本數(shù)至少0 000例(體外診斷試劑的技術(shù)指導(dǎo)原則，國家食品藥品監(jiān)督管理局)。但不同試劑以及同一試劑不同適應(yīng)證等，所需檢測的樣本數(shù)可能不同，要在滿足法規(guī)要求的情況下，選擇合適的樣本數(shù)，以便得出準(zhǔn)確的結(jié)果。
美國FDA對HIV抗體快速檢測試劑臨床研究也有樣本數(shù)量的要求，而且zui近也做了一些調(diào)整。這里所指的快速檢測試劑是檢測靜脈全血、手指全血、口腔液體以及血清和血漿樣品的試劑，而且主要是用于對HIV流行情況不清楚人群的新鮮樣品進(jìn)行的檢測。對試劑靈敏度進(jìn)行評價(jià)時(shí)，原來要求至少檢測000例HIV感染者樣品以及500例高危人群中的陽性樣品。但現(xiàn)在FDA要求企業(yè)可以根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求設(shè)計(jì)樣品的規(guī)模，但至少檢測500份新鮮的樣品，檢測近期陽轉(zhuǎn)患者的樣品，F(xiàn)DA強(qiáng)烈建議至少檢測000份高危人群樣品分析其靈敏度。對特異性研究，F(xiàn)DA原來要求至少檢測6000例HIV低危人群的新鮮樣品，現(xiàn)在要求企業(yè)可根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求確定樣品數(shù)量，但高危人群和低危人群的新鮮樣品至少各有500份，而FDA強(qiáng)烈建議應(yīng)各000份。要求該類試劑的特異性和敏感性的95％可信限的下限至少達(dá)到98％。
歐洲對用于血液篩查的HIV-／2抗體檢測試劑的臨床研究要求是：在評價(jià)試劑敏感性時(shí)，至少檢測400份HIV-抗體陽性和200份HIV-2抗體陽性的樣品，而且在HIV-l抗體陽性樣品中要至少包括40份非B亞型的樣品，每一個亞型至少有3份樣品；要至少檢測20份陽轉(zhuǎn)血清。在分析試劑特異性時(shí)，至少檢測5000份未經(jīng)篩選的獻(xiàn)血員樣品、200份住院患者的樣品(非HIV感染者)，以及00份可能引起交叉反應(yīng)的樣品，如類風(fēng)濕因子陽性樣品、其他病毒抗體陽性樣品以及孕婦樣品等。
五、檢測程序以及不一致樣品的分析
在評價(jià)試劑時(shí)為排除一些干擾因素，參比試劑以及考核試劑應(yīng)該在一致的條件下進(jìn)行檢測。例如，在同一實(shí)驗(yàn)室由同一實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員使用相同的加樣儀器以及同樣的處理設(shè)施，甚至于在同一天對樣品進(jìn)行平行檢測，所有操作將按每一種試劑說明書嚴(yán)格進(jìn)行，而且實(shí)驗(yàn)人員不知道樣品中被測物的實(shí)際狀態(tài)，即盲法檢測。
結(jié)果不一致的樣品由同一實(shí)驗(yàn)人員按同樣的方法進(jìn)行檢測，避免由于技術(shù)操作所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)錯誤。若還不一致，則由不同的實(shí)驗(yàn)人員或?qū)嶒?yàn)室用同樣的試劑以及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測，但他們不知道以前的檢測結(jié)果。盡量避免技術(shù)人員或?qū)嶒?yàn)室因素產(chǎn)生的錯誤。若仍然不一致，則應(yīng)用其他試劑進(jìn)一步核對，明確該樣品的狀態(tài)。