谷研試劑-人類免疫缺陷病毒抗體的ELISA測定

人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）目前在臨床和血站實驗室主要的檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金或硒試紙條和免疫化學(xué)發(fā)光法，zui常用的是ELISA。ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作或全自動酶免疫分析儀的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一環(huán)節(jié)的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?，F(xiàn)分述如下。

 一、臨床標(biāo)本的收集和保存

  用于ELISA測定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清（漿），有時也用到唾液、尿液等標(biāo)本。影響抗-HIV ELISA測定的標(biāo)本因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長和標(biāo)本凝固不全等。
      ．標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
      2．標(biāo)本被細(xì)菌污染 樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染。一則細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
      3．標(biāo)本貯存時間過長 標(biāo)本在2~8℃下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性。血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應(yīng)在－70℃以下。
      4．標(biāo)本凝固不全 血液采集后，如收集管中無促凝劑和抗凝劑，則血液通常在半小時后開始凝固，8~24h*凝固。日常檢驗中，常在血液還未開始凝固時即離心分離血清，此時因血液沒有*凝固，離出的“血清”并非為*的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，如將其加入微孔中，在ELISA測定過程中仍可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。因此，血液標(biāo)本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時用帶分離膠的或于中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />      5．冰凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。此外，標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。

 二、試劑準(zhǔn)備

     在有些臨床實驗室，對ELISA測定的試劑準(zhǔn)備有時比較隨意，較少有其可能會影響實驗結(jié)果的意識，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備zui為關(guān)鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來。在室溫下放置20分鐘以上后再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達到所要求的37℃，以滿足測定要求。所以，實驗室應(yīng)有保證室溫在一定范圍的措施和設(shè)施，如空調(diào)。并且這個范圍不宜過大，如可以定在23℃±2～3℃。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液，均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

 三、加血清標(biāo)本及反應(yīng)試劑

      在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器或全自動加樣系統(tǒng)加入標(biāo)本的步驟。使用微量加樣器手工加樣必須注意的關(guān)鍵點是，加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染，出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。在使用全自動加樣系統(tǒng)加樣時，則必須為一次性吸頭，反復(fù)使用的鋼針，則會因為標(biāo)本之間的交叉污染，而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，在常規(guī)檢測中，表現(xiàn)為“拖帶”現(xiàn)象。

 四、溫育

     溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關(guān)鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
      溫育這一步是臨床ELISA測定中zui容易出現(xiàn)問題的步驟。通常目前國內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時間為37℃ 30分鐘～小時。一般來說抗原抗體反應(yīng)在37℃下需要～2小時才能有較*的結(jié)合，低于小時，可能會影響測定下限。因此，關(guān)于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：（）要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時間：一般來說，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時間可能還比較長；而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成在實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題；因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內(nèi)溫度才能達到37℃，從而適當(dāng)延長板條在溫箱中的放置時間；具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應(yīng)溶液中測量觀察即可；（2）溫育溫度的選擇：在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下小時，另一種則為43℃下45分鐘；從免疫測定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來看，在較低的溫度下反應(yīng)較長的時間zui為*，如2～8℃下反應(yīng)24小時；較高的反
應(yīng)溫度，由于分子運動的加快，反應(yīng)時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能；因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應(yīng)時間的條件；（3）“邊緣效應(yīng)”的排除：以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)”的原因可能為96孔板外周孔與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同，但有研究證實在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所在。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實驗室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板孔升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。
      總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈?，放于溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。此外，采用微波或溫育時振蕩微孔板可提高溫育效率或縮短溫育時間。

 五、洗板
   固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對于ELISA測定來說，也是極其關(guān)鍵的一步。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05% Tween20的中性PBS。Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，借助其疏水基團與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度。洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反應(yīng)溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后在板孔中加滿洗液，放置2～3分鐘后，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復(fù)上述洗滌步驟3～4次，zui后在吸水紙上拍干，即可進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至*所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機。
      此外，在采用洗板機洗板時，洗板機的日常清潔維護、及時更換洗液和清潔洗液瓶，對于保證洗板質(zhì)量，避免“花板”非常重要。洗板機每次使用后，如不及時用蒸餾水*沖洗管道，則可能因為洗液中磷酸鹽緩沖液的殘留，一是導(dǎo)致管道堵塞，二是會利于細(xì)菌繁殖，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。洗液更換不及時和洗液瓶清潔不到位，同樣會致洗液的細(xì)菌污染。

六、顯色

      在目前的以HRP作為標(biāo)記酶的商品抗-HIV/2 ELISA試劑盒中，均以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物，國產(chǎn)試劑提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；某些進口試劑有可能為一瓶。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)5～30分鐘。從理論上說，37℃30分鐘才可以使HRP的底物催化反應(yīng)*，盡管在zui初的0分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25～30分鐘后，終止反應(yīng)比色測定。
      此外，在加入底物開始顯色反應(yīng)前，是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質(zhì)。以TMB為底物，整個顯色反應(yīng)過程無需避光。顯色反應(yīng)完成后，加入酸終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結(jié)果。

七、比色

    ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進行。有的同行可能會認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進行，那么此時便可以萬事大吉了。其實不然，因為當(dāng)代較為先進的酶標(biāo)儀，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測定后，有許多的陰性測定孔的吸光度值為負(fù)數(shù)或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波長下的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微孔板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點，一般不必設(shè)空白孔（除非空白本身會產(chǎn)生顏色）。如在使用雙波長比色時，仍設(shè)空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收具有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，是使用雙波長比色。

八、結(jié)果判定
  臨床ELISA測定按其表示測定結(jié)果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的結(jié)論，分別用“反應(yīng)性”（reactive）或“陽性反應(yīng)”和“非反應(yīng)性”（nonreactive）或“陰性反應(yīng)”來表示?？?HIV/2 ELISA檢測為定性測定，檢測的目的是判斷特定HIV感染的存在與否。ELISA定性測定的“反應(yīng)性”（reactive）或“陽性反應(yīng)”和“非反應(yīng)性”（nonreactive）或“陰性反應(yīng)”的判定依據(jù)是試劑盒所確定的陽性判
定值（Cut-off）。
     下面再解釋一下在ELISA定性測定結(jié)果判定中常用的一些縮寫。（）S/CO：其中S為Sample（樣本）或Specimen（標(biāo)本）的簡寫，表示的是標(biāo)本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑制法外，其它ELISA定性測定模式中，當(dāng)S/CO值大于或等于時，標(biāo)本的測定為“陽性反應(yīng)”，小于時為“陰性反應(yīng)”。（2）S/N或P/N：其中S同（），N為Negative（陰性對照）的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區(qū)別，只不過是前者將陰性對照（N）的2.倍視為Cut-off值而已。

九、結(jié)果報告及解釋

      抗-HIV/2 ELISA測定結(jié)果的報告較為簡單，報告“反應(yīng)性”（reactive）或“陽性反應(yīng)”和“非反應(yīng)性”（nonreactive）或“陰性反應(yīng)”即可。結(jié)果的解釋比較起來要復(fù)雜的多，它要求實驗室技術(shù)人員對所測定的項目有較為全面的知識基礎(chǔ)?？?HIV /2 ELISA檢測屬于初篩檢測，由于我國人群流行率低，加上實際檢測操作中的一些問題，抗-HIV/2檢測的陽性預(yù)示值可能較低，尤其是弱陽性反應(yīng)的標(biāo)本。此外，在特定疾病情況下，如自身免疫病亦會出現(xiàn)較多的假陽性。因此，ELISA檢測呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本必須進一步用蛋白印跡或核酸檢測進行確認(rèn)。此外，陰性反應(yīng)也不能*排除HIV感染的存在?，F(xiàn)在，檢驗不再是單純的實驗室測定，而已成為一門臨床醫(yī)學(xué)學(xué)科，即檢驗醫(yī)學(xué)，這就要求從事醫(yī)學(xué)檢驗工作的檢驗醫(yī)師，對所做的測定項目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時代所淘汰。
      綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現(xiàn)問題的可能原因