組織培養(yǎng)基細(xì)胞的一代生存期研究

　　所有體外培養(yǎng)基細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快（實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比時(shí)要快）。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會縮短傳代時(shí)間。

　　細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：

　　．潛伏期（Latent Phase）：

　　細(xì)胞接種培養(yǎng)基后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)0～24小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，0～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞培養(yǎng)基的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素，又稱LETS，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面，有的則來自培養(yǎng)基中的血清。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。

　　細(xì)胞培養(yǎng)基貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動活動，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24～96小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。

　　2．指數(shù)增生期：

　　這是細(xì)胞培養(yǎng)基增值zui旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂表示，即細(xì)胞群中每000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細(xì)胞培養(yǎng)基分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的和zui主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、zui后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞培養(yǎng)基相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)基液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應(yīng)混淆。

　　3．停滯期：

　　細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞培養(yǎng)基遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳～2兩代，通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞培養(yǎng)基得以恢復(fù)后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間，這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。