大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化的實驗準備
實驗原理
細菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細菌的過程。其原理是細菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復(fù)合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐*的選擇性培養(yǎng)基上。
實驗儀器與設(shè)備
1．超凈工作臺 2.低溫離心機
3. 恒溫搖床 4. 恒溫箱
5. -70℃ 6. 恒溫水浴器
實驗材料
1.氯化鈣（CaCl2） 2.胰蛋白胨
3.酵母提取物 4.氯化鈉（NaCl）
5.氨芐* 6.大腸桿菌DH5α
7.pUC19質(zhì)粒 8. 50ml離心管
9.吸頭、培養(yǎng)皿、錐形瓶等
附試劑的配制：
1. 0.1mol/L CaCl2溶液
2. LB液體培養(yǎng)基
配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：
胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g
酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g
NaCl 10g
搖動容器直至溶質(zhì)*溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,121℃濕熱滅菌20min。
3．氨芐*（Amp）,用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。
操作步驟
1．從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接于2ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2．取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)接到一個含有50ml LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中, 37℃振蕩培養(yǎng)2-3h.（此時,OD600<=0.5,細胞數(shù)務(wù)必<108/ ml,此為實驗成功的關(guān)鍵）.
3.將菌液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中,冰上放置10min.
4.離心10min（4000rpm）,回收細胞.
5.倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡.
6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。
7．0-4℃6000rpm，離心10min，回收細胞。
8．用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml懸浮細胞 。（務(wù)心放冰上）
9．分裝細胞，每200μl一份。此細胞為感受態(tài)細胞。
10．取200μl新鮮配制的感受態(tài)細胞，加入DNA 2μl（50ng）混勻，冰上放置30min。
同時做兩個對照管：
受體菌對照：200μl感受態(tài)細胞+2μl無菌水
質(zhì)粒對照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl質(zhì)粒DNA溶液
11．將管放到42℃循環(huán)水浴1-2min。
12．冰浴2min.
13．每管加800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h（慢搖）。
14．將適當體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，涂在含有氨芐*的固體培養(yǎng)基上。
15．倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16h，出現(xiàn)菌落。
