實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（5 X 106細(xì)胞）

2． 小心加入 xx 毫升預(yù)冷的 SBJ 清理液（試劑 A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞

5． 加入 xx 毫升 SBJ 清理液（試劑 A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升S B J   裂解液（試劑 B），充分混勻

10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11．強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

  15．移取 2  微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定

16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為 660nm，并置零

3． 準(zhǔn)備好 5 個(gè) 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號(hào)管

4． 按下表分別加入S B J   陰性液（試劑 D）和 SBJ標(biāo)準(zhǔn)液（試劑 H）到每個(gè)離心管， 混勻

 5． 將 1 至 5 號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表：

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取 xx 微升 SBJ 陰性液（試劑 D）到新的比色皿

2． 加入 5 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

3． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

4． 加入 xx 微升 SBJ終止液（試劑 F），混勻

5． 加入 xx 微升 SBJ 顯色液（試劑 G），混勻

6． 室溫下靜置 15 分鐘，避免光照

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

8． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 1 至 7 四次

9． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度

    （微摩爾/升）

四、 樣品背景測(cè)定

   1． 移取 xx 微升S B J 緩沖液（試劑 C）到新的比色皿

2． 加入 5 微升待測(cè)樣品（總量 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

4． 加入 xx 微升 SBJ 終止液（試劑 F），混勻

5． 加入 xx 微升 SBJ 顯色液（試劑 G），混勻

6． 室溫下靜置 15 分鐘，避免光照

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

8． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)     磷濃度

五、 樣品活性測(cè)定

1． 移取 xx 微升 SBJ緩沖液（試劑 C）到新的比色皿

2． 加入 5 微升待測(cè)樣品（總量 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 37℃溫度下孵育 2 分鐘

4． 加入 xx 微升 SBJ 反應(yīng)液（試劑 E）

5． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

6． 加入 xx 微升 SBJ 終止液（試劑 F），混勻

7． 加入 xx 微升SBJ顯色液（試劑 G），混勻

8． 室溫下靜置 15 分鐘，避免光照

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

10．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度

 {[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/

升）]X 5（體系倍數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)}÷ 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝納摩爾磷/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度） 毫克/毫升＝納摩爾磷/毫克/分鐘

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括 5 次標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定

2． 操作時(shí)，避免污染母液

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． SBJ終止液（試劑 F）和S B J 顯色液（試劑 G）具有腐蝕性，避免直接用手接觸

5． 樣品切忌使用磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理

6． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

7． 如果用戶沒有 660nm 波長(zhǎng)，可以使用 600 至 660nm 的任一波長(zhǎng)替代

8． 顯示綠色表明具有較強(qiáng)酶活性

9． 空白對(duì)照讀數(shù)應(yīng)小于 0.2

10．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為 100 微克/5 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；

11．鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性單位濃度定義：在 37℃溫度下，pH 8.0 的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分 鐘）釋放 1 微摩爾的磷

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確