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大鼠*(Cyt-C)ELISA試劑盒說明書

2009年11月20日 19:54:50人氣:493來源:廈門慧嘉生物科技有限公司

大鼠細(xì)胞色素C(Cyt-C)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定大鼠組織勻漿或其它相關(guān)生物液體中細(xì)胞色素C(Cyt-C)含量。

 

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗  Cyt-C抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗  Cyt-C抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物  TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 Cyt-C呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度( OD值),計算樣品濃度。

 

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板:一塊(96孔)

2.        標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品): 2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為20 ng/ml,做系列倍比稀釋注:不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋后,分別稀釋成20 ng/ml,10 ng/ml5 ng/ml,2.5 ng/ml,1.25 ng/ml0.625 ng/ml,0.312 ng/ml,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制10 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 20 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

3.        樣品稀釋液1×20ml。

4.        檢測稀釋液A1×10ml。

5.        檢測稀釋液B1×10ml

6.        檢測溶液A1×120μl1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100μl/孔),實際配制時應(yīng)多配制  0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A990μl檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。

7.        檢測溶液B1×120μl/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.        底物溶液1×10ml/瓶。

9.        濃洗滌液1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.    終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

11.    覆膜5

12.    使用說明書:1

 

自備物品

1.   酶標(biāo)儀(建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱)

2.   微量加液器及吸頭,EP

3.   蒸餾水或去離子水,全新濾紙

 

標(biāo)本的采集及保存

1.        組織勻漿:將動物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌,去除多余血液,勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20放置過夜,第二天,經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜,將勻漿物5000x g離心5分鐘,取上清即可檢測。

2.        其它生物標(biāo)本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注:以上標(biāo)本置4保存應(yīng)小于1周,-20-80均應(yīng)密封保存,-20不應(yīng)超過1個月,-80不應(yīng)超過2個月;標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

 

操作步驟

實驗開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫(試劑不能直接在37溶解);試  劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高時,應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?/span> 100μl,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.        棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加  檢測溶液A工作液 100μl(在使用前一小時內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜, 37反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。

4.        每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100μl,酶標(biāo)板加上覆膜37反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。

6.        依序每孔加底物溶液90μl,酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。

7.        依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng),此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測。

 

1.  試劑準(zhǔn)備:所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。

2.   加樣:加樣或加試劑時,請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)控制在  10分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。

4.   洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶 標(biāo)儀讀數(shù)。

5.  試劑配制:Detection ADetection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10μl),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

6.  反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7.  底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。

    建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

 

洗板方法

1.  手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。

2.  自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

 

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠Cyt-C,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

 

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)), OD值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,如 curve expert 1.3,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

 

檢測范圍:0.312 ng/ml - 20 ng/ml

 

zui低檢測限0.078 ng/mL

 

說明

1.         在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.         試劑盒保存:請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20,其余試劑短期保存請置于4,長期保存則置于-20。

3.         濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

5.         所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

6.         有效期:6個月。

 

廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)代理眾多生命科學(xué)領(lǐng)域的。致力于各種ELISA試劑盒、免疫組化試劑盒、一抗二抗、細(xì)胞因子、生物試劑、移液器、耗材的銷售推廣及服務(wù)工作。
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