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大鼠細胞色素C(Cyt-C)ELISA試劑盒說明書
本試劑盒僅供體外研究使用!
預期應用
ELISA法定量測定大鼠組織勻漿或其它相關生物液體中細胞色素C(Cyt-C)含量。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗 Cyt-C抗體的微孔中依次加入標本或標準品、*化的抗 Cyt-C抗體、HRP標記的親和素,經過*洗滌后用底物 TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 Cyt-C呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度( OD值),計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板:一塊(96孔)
2. 標準品(凍干品): 2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為20 ng/ml,做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋)后,分別稀釋成20 ng/ml,10 ng/ml,5 ng/ml,2.5 ng/ml,1.25 ng/ml,0.625 ng/ml,0.312 ng/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,臨用前15分鐘內配制。如配制10 ng/ml標準品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 20 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液:1×20ml。
4. 檢測稀釋液A:1×10ml。
5. 檢測稀釋液B:1×10ml。
6. 檢測溶液A:1×120μl(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100μl/孔),實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內配制。
7. 檢測溶液B:1×120μl/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
11. 覆膜:5張
12. 使用說明書:1份
自備物品
1. 酶標儀(建議參考儀器使用說明提前預熱)
2. 微量加液器及吸頭,EP管
3. 蒸餾水或去離子水,全新濾紙
標本的采集及保存
1. 組織勻漿:將動物的組織標本先用PBS洗滌,去除多余血液,勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20℃放置過夜,第二天,經過二次反復凍融破膜,將勻漿物5000x g離心5分鐘,取上清即可檢測。
2. 其它生物標本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
注:以上標本置4℃保存應小于1周,-20℃或-80℃均應密封保存,-20℃不應超過1個月,-80℃不應超過2個月;標本溶血會影響zui后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試 劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量,如樣品濃度過高時,應對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。
1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?/span> 100μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加 檢測溶液A工作液 100μl(在使用前一小時內配制),酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。
3. 溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100μl,酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
5. 溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,酶標板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測。
1. 試劑準備:所有試劑都必須在使用前達到室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
2. 加樣:加樣或加試劑時,請注意在吸取標本 / 標準品,酶結合物或底物時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的 “預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在 10分鐘內,如標本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。
3. 孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,酶標板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應盡快進行下步操作,任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4. 洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶 標儀讀數(shù)。
5. 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,并使用相應的稀釋液配制,不能混淆。請配置標準品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10μl),以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6. 反應時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7. 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。
建議檢測樣品時均設雙孔測定,以保證檢測結果的準確性。
如標本中待測物質含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
洗板方法
1. 手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。
2. 自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠Cyt-C,且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標), OD值為橫坐標(對數(shù)坐標),在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如 curve expert 1.3,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
檢測范圍:0.312 ng/ml - 20 ng/ml
zui低檢測限:0.078 ng/mL
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果。
2. 試劑盒保存:請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃,其余試劑短期保存請置于4℃,長期保存則置于-20℃。
3. 濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質,此為正常現(xiàn)象,不會對實驗結果造成任何影響。
5. 所有的樣品都應管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
6. 有效期:6個月。
廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)代理眾多生命科學領域的。致力于各種ELISA試劑盒、免疫組化試劑盒、一抗二抗、細胞因子、生物試劑、移液器、耗材的銷售推廣及服務工作。
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