人血清白蛋白（HSA）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中HSA含量。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用競爭抑制酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中待測物質(zhì)水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被抗體的微孔中同時(shí)加入酶標(biāo)的抗原和待測抗原，被測抗原與酶標(biāo)記抗原對特異性抗體進(jìn)行競爭結(jié)合。經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。待測標(biāo)本濃度越高，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān)，而與樣品中待測物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。  

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.        標(biāo)準(zhǔn)品：2瓶，每瓶臨用前以0.8 ml樣品稀釋液稀釋，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為100 ug/mL，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）后，分別稀釋成100 ug/mL，33.3 ug/mL，11.1 ug/mL，3.7 ug/mL，1.23 ug/mL，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ug/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制33.3 ug/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 100 ug/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有1 ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測溶液A：2×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔50ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

5.         檢測稀釋液A：2×10ml/瓶。

6.         底物溶液：1×10ml/瓶。

7.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

8.         終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

9.        覆膜：1×5張

自備物品

1.   酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）

2.   微量加液器及吸頭，EP管

3.   蒸餾水或去離子水，全新濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1.        血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.        血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.        其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4.        樣本處理： 血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋500-1,000倍。標(biāo)本使用0.1 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過2個(gè)月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。用離心管稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本，分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50ul，然后立即每孔加檢測溶液A工作液 50ul，輕輕振動(dòng)，混勻，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.        棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

3.        依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘以內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的后3-4孔有明顯的梯度蘭色，前3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

4.        依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

5.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：

1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2.   加樣：加樣或加試劑時(shí)，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。

4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.  試劑配制：Detection A在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品或檢測溶液A工作液。

6.  反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

    建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

2.  自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人HSA，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

檢測范圍：1.23 ug/mL - 100 ug/mL

zui低檢測限：0.3 ug/mL

說明

1.         在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

2.         試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃，其余試劑短期保存請置于4℃，長期保存則置于-20℃。

3.         濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

5.         所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

6.         有效期：6個(gè)月。

7.         本操作說明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。

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