大鼠褪黑素 （melatonin）酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，組織及相關液體樣本中褪黑素 （melatonin）的含量。實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠褪黑素 （melatonin）水平。用純化的大鼠褪黑素 （melatonin）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入褪黑素（melatonin），再與 HRP標記的羊抗鼠抗體結合，形成抗體 -抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的褪黑素 （melatonin）呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度（ OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠褪黑素 （melatonin）濃度。
試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1.  血清：室溫血液自然凝固 10-20分鐘，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2.  血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20分鐘后，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3.  尿液：用無菌管收集，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4.  細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20分
鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.  組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于 -20℃保存，但應避免反復凍融 .

7.  不能檢測含 NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（ HRP）活性。

操作步驟：

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10孔，在*、第二孔中分別加標準品 100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉，再各取 50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，濃度分別為 36 ng/L，24 ng/L，12 ng/L，6 ng/L，3 ng/L）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育3 0分鐘。

4. 配液：將 30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T的 20倍）倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此重復 5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同 3。

8. 洗滌：操作同 5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零， 450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）。測定應在加終止液后 15分鐘以內進行。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在 5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD值大于標準品孔*孔的 OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準 .

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：以標準物的濃度為橫坐標， OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R值為 0.95以上。
2. 批內與批見應分別小于 9%和 11%

檢測范圍：
1 ng/L -40 ng/L
保存條件及有效期：
1 2-8℃。
2 6個月

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