Oligo在分子生物學(xué)研究、臨床診斷和藥物治療方面很重要，而對(duì)于實(shí)驗(yàn)成功與否，選擇適當(dāng)?shù)姆椒兓疧ligo其實(shí)是十分關(guān)鍵的。

一、為什么要純化？

Oligo有機(jī)化學(xué)原理是利用結(jié)合于固相載體（CPG）上的核甘酸作為3'端*個(gè)核甘酸與另一個(gè)受保護(hù)的去氧核甘酸在催化劑催化下進(jìn)行縮合反應(yīng)，隨后在氧化脫去5'端保護(hù)基DMT后，再與第三個(gè)受保護(hù)的去氧核甘酸縮合，如此循環(huán)達(dá)到合成Oligo之目的，縮合合成結(jié)束后再利用氨解方法脫去Oligo上之保護(hù)基。一般A、C鹼基通常採用苯甲醯基保護(hù)，G鹼基採用異丁醯基保護(hù)，亞磷酸採用氰乙基保護(hù)，T鹼基則不保護(hù)。目前固相合成Oligo均在DNA合成儀上進(jìn)行。前述方法合成之Oligo在氨解脫去保護(hù)基后含有大量雜質(zhì)，純度極低。其主要雜質(zhì)為脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨以及氰磷基上脫下的氰乙基等，以致粗產(chǎn)物中Oligo含量僅約15%左右。粗產(chǎn)物中另一雜質(zhì)則為合成時(shí)產(chǎn)生的短鏈。儘管目前合成方法的每一次縮合反應(yīng)效率均可達(dá)97%以上，但累積效率并不高。以長度為20鹼基和50鹼基之Oligo為例，97.5%的二十次方約為60%，97.5%的五十次方則只有28%。因此，在粗產(chǎn)物中目標(biāo)Oligo的含量甚至連10%都不到。前述雜質(zhì)，尤其是存在于粗產(chǎn)物中的大量短鏈與鹽，不但造成定量不準(zhǔn)確，而且有礙下一步的反應(yīng)，故而Oligo的純化并不是可有可無的步驟，而是*的工作。

二、選擇什么方法純化Oligo？

近年來，合成Oligo的儀器確實(shí)有了很大的進(jìn)步，但其成就主要集中在成功率提升與試劑消耗降低等方面，從化學(xué)合成原理上來看，粗產(chǎn)物中大量短鏈與鹽的存在仍然無法避免。雖然未經(jīng)純化的Oligo仍能用于一般PCR反應(yīng)，但成功率較低。一般來說，除用戶特別要求外，代為合成Oligo的公司大多不提供未經(jīng)純化之Oligo粗產(chǎn)物，其純化Oligo的方法約可歸納為下列四類：

1. 脫鹽：常用的方法有下述三種

A. 酒精沉淀。粗產(chǎn)物中的氨鹽等雜質(zhì)可溶于酒精，而Oligo在適當(dāng)鹽濃度下不溶于酒精。此一方法脫鹽十分簡便，但回收產(chǎn)率較低，尤其是較短的Oligo。大多數(shù)Oligo合成公司採用此法脫鹽。

B. 分子篩。粗產(chǎn)物中的鹽可利用Oligo和鹽分子量的差別而分離，但此一方法操作複雜，并不理想。

C. RPC柱。反相柱脫鹽方法是較理想的脫鹽方法，其原理是利用Oligo可專一性地吸附于RPC柱上而達(dá)到脫鹽目的。

2. OPC柱純化

OPC柱純化Oligo的原理是利用保留于5'端的DMT保護(hù)基可專一性地吸附于OPC柱上，而短鏈Oligo由于沒有DMT保護(hù)基，不易被OPC柱吸附，從而達(dá)到脫鹽純化的目的。使用此一方法純化之Oligo適用于一般PCR或要求較高之PCR反應(yīng)。但使用此一方法純化之Oligo常溷有少一到二個(gè)鹼基之短鏈，因此并不適于基因合成和DNA定序之用，另外此一方法亦不適于純化大于40個(gè)鹼基之Oligo，產(chǎn)率較低。

3. HPLC純化

HPLC純化方法和OPC柱純化方法在原理上頗為接近，也是利用5'端DMT保護(hù)基與其他不帶保護(hù)基的Oligo在管柱上吸附能力不同達(dá)成分離純化的目的，然而由于採用HPLC儀器，其純化效果優(yōu)于OPC柱純化。只要Oligo長度不超過40個(gè)鹼基，用HPLC純化的Oligo可用于PCR反應(yīng)、基因合成和DNA定序。但HPLC方法不適于純化超過40個(gè)鹼基之Oligo，在此狀況下，雖然目標(biāo)Oligo帶有5'端DMT保護(hù)基，其與不帶DMT保護(hù)基的短鏈在管柱上之吸附能力差異不大，因此分辨率降低，純化之Oligo常含有缺少幾個(gè)鹼基的短鏈。此外，本法對(duì)G鹼基較多之Oligo也不適用。若採用本法純化已脫去DMT保護(hù)基之Oligo，由于其留置時(shí)間僅反映其表面疏水性，不易用以判斷Oligo之長短。

4. PAGE純化

聚丙烯醯氨凝膠電泳（PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是利用電場作用下Oligo泳動(dòng)速率差異分離純化樣品。由于同時(shí)利用靜電作用與分子篩效應(yīng)，并可採取提高分辨率的變性手段，PAGE方法具有*之分辨率，長度僅相差0.2%（即500個(gè)鹼基中的1個(gè)鹼基）的DNA分子即可分辨。從凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求zui高的實(shí)驗(yàn)。PAGE純化方法是純化效果*的方法，使用此一方法純化的Oligo可用于任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括PCR反應(yīng)、基因合成和DNA定序等。PAGE純化對(duì)于Oligo長度幾乎沒有限制，即使長達(dá)上百個(gè)鹼基之Oligo也能清楚分辨幾個(gè)鹼基的差異。

雖然PAGE純化之效果*，但一般很少採用此一方法純化。其主要原因?yàn)榇艘环椒ǚ浅ＹM(fèi)時(shí)、費(fèi)人工，并有毒害，因此十分昂貴。一般採用此法純化一股Oligo，除基本費(fèi)用外，仍需加收800至1200元純化費(fèi)，以往許多實(shí)驗(yàn)室只在進(jìn)行少數(shù)要求較高實(shí)驗(yàn)，如基因合成和DNA定序時(shí)採用此一方法。但在需要大量高品質(zhì)Oligo進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，採用此法顯然成本過高。生工公司為協(xié)助研究單位能以有限的經(jīng)費(fèi)完成更高水準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)與國外合作廠商反覆協(xié)調(diào)，終于爭取到約為市面行情1/3之PAGE純化價(jià)格，希望能讓研究單位有更多的機(jī)會(huì)採用此一效果*的純化方法。生工公司國外合作廠商目前推出之PAGE純化方桉結(jié)合PAGE與RPC柱純化，先用PAGE純化去除短鏈Oligo，再用RPC柱純化，效果優(yōu)于其他公司採用之單一PAGE純化。

原文地址:/biotech/exp/TechArticle/2011/f819561566.html