人（Human）白介素4（IL-4）ELISA

【資料簡介】

本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

人（Human）白介素4（IL-4）ELISA

檢測試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙蛋白兩步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)包被捕獲蛋白的透明微孔中，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)本，溫育并洗滌后，再加入HRP標(biāo)記的檢測蛋白，溫育并洗滌后，用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測蛋白濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.  標(biāo)準(zhǔn)品臨使用時(shí)再稀釋，稀釋后用剩的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)立刻丟棄，不可保存。

3.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱	96孔配置	48孔配置	備注
微孔酶標(biāo)板	12孔×8條	12孔×4條	無
標(biāo)準(zhǔn)品	0.6mL	0.6mL	按說明書進(jìn)行稀釋
*	6mL	3mL	無
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	6mL	3mL	無
檢測蛋白-HRP	6mL	3mL	無
20×洗滌緩沖液	25mL	15mL	按說明書進(jìn)行稀釋
底物A	6mL	3mL	無
底物B	6mL	3mL	無
終止液	6mL	3mL	無
封板膜	2張	2張	無
說明書	1份	1份	無
自封袋	1個(gè)	1個(gè)	無

試劑的準(zhǔn)備

1.  標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品（1600pg/mL）在實(shí)驗(yàn)前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進(jìn)行倍比稀釋，得到6個(gè)濃度點(diǎn)（包括標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)）：1600、800、400、200、100、50pg/mL

2.  20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板4-5次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板4-5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條密封放回4℃。

2.  除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加*40μL（即樣本稀釋5倍），用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

3.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）。

4.  除空白孔外，每孔加入檢測蛋白-HRP 50μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5.  重復(fù)步驟3的操作。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

1.  每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。

2.  繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本濃度。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于6號標(biāo)準(zhǔn)品。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(gè)月

免責(zé)聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。

2.   嚴(yán)格按照說明書操作，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。