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硝酸還原酶的測(cè)定法
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關(guān) 鍵 詞 | 硝酸還原酶,萘基乙烯二胺,三氯乙酸水 |
- 【資料簡(jiǎn)介】
硝酸還原酶(NR)是植物氮素同化的關(guān)鍵酶,它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì)–氨基苯磺酸(或?qū)?ndash;氨基苯磺酰胺)及α–萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下:
生成的紅色偶氮化合物在540nm波長(zhǎng)下有zui大吸收峰,可用分光光度法測(cè)定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法?;铙w法步驟簡(jiǎn)單,適合快速、多組測(cè)定。離體法復(fù)雜,但重復(fù)性較好。
二、儀器與用具
分光光度計(jì);真空抽氣泵(或20ml注射器筒);天平;單面刀片;保溫箱(或恒溫水浴);刻度試管(15ml);移液管(5ml×2,2ml×8,1ml×2)。
三、試劑
1. *標(biāo)準(zhǔn)液 稱取分析純NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml,吸取5ml用水稀釋定容至1000ml,即為每ml含NaNO2 5μg(亞硝態(tài)氮近似1μg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸緩沖液:K2HPO4 19.24g,KH2PO4 2.2g,加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%(W/V)對(duì)-氨基苯磺酸溶液:稱取1.0g加入25ml濃HCl中,用蒸餾水定容至100ml。
4. 0.2%(W/V)α-萘胺溶液:稱取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中,用蒸餾水定容至100ml。
5. 30%三氯乙酸溶液:75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3(0.1mol/L)、異丙醇(1% V/V)、磷酸緩沖液(0.1mol/L)混合液:稱3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸緩沖液中,再加3ml異丙醇混勻。
硝酸還原酶活力測(cè)定(活體法)
四、方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按表13-1順序加試劑,即配成0-2.0μg的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在30℃保溫箱或恒溫水浴中保溫30min,然后在540nm波長(zhǎng)下比色。以亞硝態(tài)氮(μg)為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線或建立回歸方程。
表13-1 各試劑加入順序
2. 酶反應(yīng)和酶活性測(cè)定
(1)取樣:將材料(小麥、玉米等作物葉片)洗凈,用蒸餾水沖洗,濾紙吸干。在葉片中部打取直徑1cm的圓片(或剪成0.5~1.0cm2的小塊),混勻后每個(gè)樣品稱0.5~1.0g 3份,放入試管并編號(hào)。
(2)反應(yīng):向各試管加入KNO3·異丙醇·磷酸緩沖液混合液9ml,其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混勻作對(duì)照。然后將所有試管置真空干燥器中接真空泵抽氣,反復(fù)幾次直至葉片沉在管底。將各試管置30℃下于黑暗處保溫30min,分別向處理管加1.0ml三氯乙酸,搖勻終止酶活性。
(3)比色:將各試管靜置2min,吸取上清液2ml加入另一組試管,以對(duì)照管做參比,按標(biāo)準(zhǔn)曲線做法進(jìn)行顯色測(cè)定,并計(jì)算酶活性(Nμg·g-1·h-1)。
式中 C:反應(yīng)液催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量(μg);
V1:提取酶液時(shí)加入的緩沖液體積(ml);
V2:酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積(ml);
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