硝酸還原酶的測(cè)定法

【資料簡(jiǎn)介】

硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì)–氨基苯磺酸（或?qū)?ndash;氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下：
生成的紅色偶氮化合物在540nm波長(zhǎng)下有zui大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡(jiǎn)單，適合快速、多組測(cè)定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。
二、儀器與用具
分光光度計(jì)；真空抽氣泵（或20ml注射器筒）；天平；單面刀片；保溫箱（或恒溫水?。?；刻度試管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、試劑
1. *標(biāo)準(zhǔn)液 稱取分析純NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀釋定容至1000ml，即為每ml含NaNO2 5μg（亞硝態(tài)氮近似1μg/ml）的標(biāo)準(zhǔn)液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸緩沖液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）對(duì)-氨基苯磺酸溶液：稱取1.0g加入25ml濃HCl中，用蒸餾水定容至100ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：稱取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸餾水定容至100ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、異丙醇（1% V/V）、磷酸緩沖液（0.1mol/L）混合液：稱3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸緩沖液中，再加3ml異丙醇混勻。
硝酸還原酶活力測(cè)定（活體法）
四、方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按表13-1順序加試劑，即配成0-2.0μg的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在30℃保溫箱或恒溫水浴中保溫30min，然后在540nm波長(zhǎng)下比色。以亞硝態(tài)氮（μg）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線或建立回歸方程。
表13-1 各試劑加入順序
2. 酶反應(yīng)和酶活性測(cè)定
（1）取樣：將材料（小麥、玉米等作物葉片）洗凈，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干。在葉片中部打取直徑1cm的圓片（或剪成0.5~1.0cm2的小塊），混勻后每個(gè)樣品稱0.5~1.0g 3份，放入試管并編號(hào)。
（2）反應(yīng)：向各試管加入KNO3·異丙醇·磷酸緩沖液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混勻作對(duì)照。然后將所有試管置真空干燥器中接真空泵抽氣，反復(fù)幾次直至葉片沉在管底。將各試管置30℃下于黑暗處保溫30min，分別向處理管加1.0ml三氯乙酸，搖勻終止酶活性。
（3）比色：將各試管靜置2min，吸取上清液2ml加入另一組試管，以對(duì)照管做參比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線做法進(jìn)行顯色測(cè)定，并計(jì)算酶活性（Nμg·g-1·h-1）。
式中 C：反應(yīng)液催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量（μg）；
V1：提取酶液時(shí)加入的緩沖液體積（ml）；
V2：酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積（ml）；