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牛型放線菌PCR試劑盒實驗原理

2020年07月17日 14:17:34人氣:106來源:上海一研生物科技有限公司

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關 鍵 詞牛型放線菌PCR試劑盒,牛型放線菌PCR試劑盒
【資料簡介】

牛型放線菌PCR試劑盒說明書

產品名稱:牛型放線菌PCR試劑盒
產品規(guī)格:50T
原理是由一對引物介導,能在動植物體外對特定基因(DNA)斷進行快速酶促擴增,經過n個熱循環(huán)擴增,擴增產物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0<E<1,擴增效率=倍,使得檢測擴增產物中的特定基因成為可能。產品僅用于科研實驗

特異性強

PCR反應的特異性決定因素為:

①引物與模板DNA特異正確的結合;

②堿基配對原則;

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;

④靶基因的特異性與保守性。


產品特點:
本產品就是根據(jù)保守區(qū)設計引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產品。
具有下列特點:
1.根據(jù) 指標的保守序列設計的專一性引物,與相關病毒無交叉反應。
2.靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個數(shù)量級,可以達到幾百拷貝/反應。
3.即開即用,用戶只需要提供樣品模板,操作簡單,定量準確快速。
4.一管式熒光定量 PCR 檢測,避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6.本產品只適用于科研,不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分                            成分
 2×qPCR MagicMix                 500 μL(裝 A 袋)
微量核酸稀釋液(熒光 PCR )1 mL(裝 A 袋)
PCR 引物混合物                        100 μL(裝 A 袋)
基因陽性對照                           50 μL(裝 B 袋)
DNA 病毒裂解液(試用裝)       15 次(9 mL)
使用手冊                              1 份
運輸及保存:低溫運輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準備區(qū)、B 袋的陽性對照好分開放置),
自備試劑DNA 模板、10×ROX(根據(jù)機型決定,具體見使用方法)。
應用案例
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(好用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
牛型放線菌PCR試劑盒設置 qPCR 反應(20  μL 體系,在樣品制備室進行)
9.在 PCR 管中加入下列成分(待測樣品需要做三次重復,下表只列出一次。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加):
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。
10. 蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行 PCR(具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行
優(yōu)化)。
過程溫度時間
預變性95℃1 分鐘
PCR 反應95℃15 秒
(30 個循環(huán))60℃15 秒
72℃15 秒
11. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時,
譜在 530 nm。
四、數(shù)據(jù)處理
12. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品
的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
組成及試劑配制:

1、酶標板:一塊(96孔)

2、 標準品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液:1×20ml。

4、 檢測稀釋液A:1×10ml。

5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
注意事項:

1.基礎程序;

2.擴增溫度和延伸溫度;

3.反應時間;

4.循環(huán)次數(shù);

5.PCR 反應液的配制;

6.PCR技術的基本原理;

7.PCR的反應動力學;

8.PCR擴增產物;

9.PCR反應體系與反應條件。
【儲存條件及有效期】:

-20℃避光保存,避免反復凍融,有效期6個月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運輸】

u 樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集;

u 存放:樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h,-70℃以下可保存,但應避免反復凍融(多凍融3次);

u 運輸:采用泡沫箱加冰密封進行運輸。

【自備試劑】:產品僅用于科研實驗

上海一研生物科技有限公司作者

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