SDS-PAGE檢測蛋白表達

【資料簡介】

一、材料與儀器

30%丙烯酰胺溶液；1.5mol/L Tris-HCl分離膠緩沖液，pH8.8；1.0mol/L Tris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8；電泳緩沖液，pH8.3；10%SDS溶液；10%過硫酸銨溶液；樣品處理液；染色液；脫色液；電泳玻璃板，電泳電源架，電泳槽，電泳儀等；蛋白Mark。

二、方法與步驟

1)分離膠和濃縮膠配制

按下表比例分別配制分離膠和濃縮膠：

表1 聚丙烯酰胺組成

試劑：	體積（ ml ）
	分離膠	濃縮膠
H2 O	2.8	3.4
Acrgl-bis	4.5	0.83
Tris-Hcl	2.5 （ pH8.8 ）	0.63 （ pH6.8 ）
SDS （ 10 ％）	0.100	0.050
Ap （ 10 ％）	0.100	0.050
TEMED	5 μ l	5 μ l

2)凝膠板的準備

a)洗板：

將洗潔精用溫水稀釋后，用它浸透海綿擦洗二塊玻璃板，然后用自來水洗凈，再用酒精將板擦干。

b)配板：

將二塊玻璃板疊放整齊，用夾子兩邊夾好，下沿兩邊角可用凡士林封住縫隙，將這二塊玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下緣劃線，指示灌膠位置。拔去梳子。

3)灌膠

a)分離膠：

在分離膠的配置燒杯中按表2-7 加料，混勻后利用滴管將分離膠（避免氣泡產(chǎn)生）滴入二塊玻璃板之間，至液面達到梳子下緣1cm 處。用滴管緩慢加入水，注意不要沖亂膠面。靜置，待分離膠聚合后，倒去或用濾紙吸去水層。

b)濃縮膠：

在濃縮膠的配置燒杯中按配比加料，混勻后即刻用滴管加濃縮膠（避免氣泡產(chǎn)生）覆于二塊玻璃板之間的分離膠之上至滿，輕輕插入梳子。靜置待其凝結(jié)后，即制成凝膠板。用筆在梳子形成的凝膠凹口部位作好記號，指示樣品點入時位置。

4 ）樣品處理

取樣：2ml （2 管，1ml / 管）

a ）工程菌：誘導前培養(yǎng)2.5h 每瓶加入180μl 的IPTG 誘導劑，誘導培養(yǎng)2h 取樣： 2ml （2 管，1ml / 管）

b ）樣品6000 轉(zhuǎn)離心10 min ，收獲包含體

c ）*倒干，誘導前樣品：一管中加入30μl 雙蒸水，打散后加入另一管中，打散；

d)誘導后樣品：一管中加入50μl 雙蒸水，打散后加入另一管中，打散

e ）等體積加loading buffer ：誘導前加30μl ,誘導后加50μl

f ）沸水浴10 min ，煮完后以15000 轉(zhuǎn)離心10 min ，取上清液走電泳

g ）對照菌同樣操作

h ）樣品及mark 和loading buffer 都各取15μl 點樣，點樣順序按；對照菌誘導后、對照菌誘導前、工程菌誘導前、工程菌誘導后，一起走電泳的兩組間點mark ，zui右邊的泳道點loading buffer ，走SDS ―聚丙烯酰胺凝膠電泳

1)電泳

a)將二塊玻璃板制成的凝膠板上的夾子卸去，擦掉下沿兩邊角的凡士林。

b)將凝膠板垂直靠在電泳槽里的電源架上，使凝膠板的凹沿面靠向電源架。通常兩塊凝膠板共用一個電源架。

c)將凝膠板與電源架按要求固定于電源槽內(nèi)。按要求加入電泳緩沖液，使分別加入在兩塊凝膠板中間電源架內(nèi)的電泳緩沖液與加入在電泳槽中的電泳緩沖液互不相通。輕輕地拔去凝膠板內(nèi)的梳子。

d)取處理后的樣品液，用微量進樣器吸取適量樣品液，將樣品液緩緩加入凝膠板內(nèi)地凹口部位（樣品點入處）。注意不要沖散樣品。

e)用二根導線連接電泳槽與電泳儀，注意紅色與黑色電極的插頭和插口相配。接通電源?？刂齐妷涸跐饪s膠中為70 ― 80V ，這次實驗我們控制在75V ，走過濃縮膠后電壓調(diào)為120V 。電泳時觀察凝膠板上的樣品溴酚藍的色條帶走至近底端1cm 時，停止電泳。關(guān)閉電源。然后從電泳槽內(nèi)小心取出凝膠板。

2)染色

a)用刀片或薄板將凝膠板外的兩塊玻璃板輕輕撬開，使凝膠傾伏在其中一塊玻璃板上。

b)用刀片在凝膠上沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，并在分離膠的左上角切掉一小角，以標記樣品順序。

c)然后將分離膠小心移入染色器皿中。

d)在染色器皿中加入100 ml 染色液，加蓋，染色3 小時。

3)脫色

將染色液倒去。染色的凝膠用水漂洗數(shù)遍，瀝干水后置于染色皿中，再加入100 ml 脫色液，加蓋，脫色至染色的凝膠經(jīng)脫色后能清晰顯示出蛋白條帶止。