紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量

【資料簡介】

蛋白質(zhì)分子中，、苯和殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。

紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH₄）2SO₄等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其值。

此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中和含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。

1.280nm的光吸收法

因蛋白質(zhì)分子中的、苯和在280nm處具有zui大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是zui常用的紫外吸收法。

測定時，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時，A280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。

許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A1%1cm）有文獻數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1%1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時的光吸收值）的關(guān)系。文獻值A(chǔ)1%1cm,λ稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。

蛋白質(zhì)濃度= (A280′10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)

(Q 1%濃度?10mg/ml)

2.280nm和260nm的吸收差法

核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8

純核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5

含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)

此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。

3.215nm與225nm的吸收差法

蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。

用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225

以吸收差D為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

本方法在蛋白質(zhì)濃度20~100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度成正比，NaCl、（NH₄）2SO₄以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1N NaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無顯著影響。

4.肽鍵測定法

蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50~500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱座標(biāo),蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

進行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質(zhì)的峰位。

本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以用無機鹽，無機堿和水溶液進行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。