目的基因的PCR克隆

【資料簡介】

5.1實(shí)驗(yàn)原理 
5.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的基本構(gòu)成 
PCR指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴(kuò)增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。 
PCR基本原理是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3’末端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到程度的擴(kuò)增。在微量離心管中，加入與待擴(kuò)增的DNA片段兩端已知序列分別互補(bǔ)的兩個引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板、四種dNTP溶液、耐熱Taq dna聚合酶、Mg2+等。反應(yīng)時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態(tài)；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重復(fù)改變溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個周期，反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。因此PCR循環(huán)過程為三部分構(gòu)成：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成。 
（1）模板DNA的變性 
模板DNA加熱到90~95℃時，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變性。變性溫度與DNA中G-C含量有關(guān)，G-C間由三個氫鍵連接，而A-T間只有兩個氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。對于高G-C含量的模板DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97℃，時間適當(dāng)延長，即所謂的熱啟動。 
（2）模板DNA與引物的退火 
將反應(yīng)混合物溫度降低至37~65℃時，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間一般為1～2min。 
（3）引物的延伸 
DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。在72℃條件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40～60個堿基/秒。經(jīng)過一輪“變性-退火-延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個循環(huán)需2～4min，一次PCR經(jīng)過30～40次循環(huán)，約2～3h。擴(kuò)增初期，擴(kuò)增的量呈直線上升，但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)到一定比值時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺效應(yīng)”，即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。 
5.1.2 PCR反應(yīng)的五個元素 
參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種：引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。

5.1.2.1 引物 
引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 
引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則： 
（1）引物長度 
長度要求在15～30bp，常用為20bp左右，引物過短時會造成Tm值過低，在酶反應(yīng)溫度時不能與模板很好的配對；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應(yīng)的zui適溫度，且合成長引物還會使費(fèi)用大大增加。 
（2）引物堿基構(gòu)成 
引物的G+C含量以40～60%為宜，因?yàn)镚+C含量過高或過低都會直接造成Tm值的過高或過低，都不利PCR反應(yīng)的進(jìn)行。ATGC隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 
（3）引物二級結(jié)構(gòu) 
應(yīng)盡量避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，并且兩條引物間不能形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則形成引物二聚體，PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生非特異的條帶。引物自身也應(yīng)無回文對稱結(jié)構(gòu)（限制性酶切位點(diǎn)除外），防止形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。