細(xì)胞AMP含量試劑盒檢測HPLC法

【資料簡介】

細(xì)胞.植物AMP含量試劑盒檢測HPLC法測定意義： 
AMP廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。
測定 AMP含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。 
測定原理： 
AMP在 254 nm下有吸收峰，可以利用液相色譜法測定其含量。 
需自備的儀器和用品： 
液相色譜儀、低速離心機(jī)、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器（水系，50個(gè)，0.22μm）、濾
膜（水系和有機(jī)系各1 個(gè)，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可調(diào)式移液器、樣品瓶（50
個(gè)，2mL）、甲醇（色譜級(jí)，300 mL）和蒸餾水。 
試劑的組成和配制： 
試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存； 
試劑二：液體60mL×1瓶，4℃保存； 
試劑三：粉劑1×1 瓶，粉劑 2×1瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑2 溶解
后倒入 1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至 1000mL，形成流動(dòng)相緩沖液基質(zhì)（注：試劑瓶
中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃可保存 1 周； 
試劑四：AMP標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×1 支，-20℃保存； 
實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作： 
1、將蒸餾水1000 mL、流動(dòng)相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 和甲醇 300 mL用 0.45 μm的濾膜抽濾，
以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水和緩沖液基質(zhì)用水系濾膜抽濾，甲醇
用有機(jī)系濾膜抽濾）。 
2、流動(dòng)相的配制：將抽濾完畢的流動(dòng)相緩沖液基質(zhì) 1000 mL與甲醇配比為 99.9：0.1（v/v），
即取 999mL緩沖液基質(zhì)與 1mL甲醇混合。 
3、將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 99%的甲醇，  10%的甲醇，蒸餾水各 250 mL。 
將 2 和 3 中的溶劑超聲20 分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。 
AMP的提?。?nbsp;
1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g） ：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g
組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿，4000g常溫離心 15 min，取上清液，加入等體積
的試劑二，混勻，4000 g常溫離心 15 min，取上清，針頭式過濾器過濾后待測。 
2、細(xì)胞或細(xì)菌的處理：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)
量（104
個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL
試劑一） ，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30
次）；4000  g  常溫離心15  min，取上清液，加入等體積的試劑二，混勻，4000  g常溫離心
15 min，取上清，針頭式過濾器過濾后待測。 
標(biāo)準(zhǔn)品的配制： 
在試劑四中加入 1mL蒸餾水，配成 5mg/mL 母液，將母液用蒸餾水分別稀釋成 100 μg/mL、
80μg/mL、60μg /mL、40 μg /mL和 20 μg /mL的 AMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液。針頭式過濾器過濾后待
測。 
AMP含量測定操作步驟： 
1.  開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量 20 μL，流速
1 mL/min，保留時(shí)間 10min，檢測波長 254nm，設(shè)置完畢保存方法組。 
2.  用 99%的甲醇、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序過色譜柱30min。 
3.  用流動(dòng)相過柱子，待基線穩(wěn)定后開始加樣。 
4.  加入標(biāo)準(zhǔn)品 20  μL，在 10min內(nèi)可分離 AMP，  AMP的保留時(shí)間在7min左右，（柱子不
同，保留時(shí)間有差異），計(jì)算不同濃度的AMP標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。 
5.  加入樣品20 μL，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測 AMP的峰面積。 
AMP含量的計(jì)算： 
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算 AMP 標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品峰面積代
入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品 AMP含量。 
細(xì)胞.植物AMP含量試劑盒檢測HPLC法注意事項(xiàng)： 
1、 為了避免使用過程中柱壓過大，流速由小到大調(diào)節(jié)。 
2、 使用完畢時(shí)，由于流動(dòng)相含有緩沖鹽，用水沖洗柱子1 小時(shí)，以防止緩沖鹽結(jié)晶堵塞色
譜柱，然后用 10%的甲醇、99%的甲醇按甲醇濃度從小到大的順序洗色譜柱30min。 
3、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中 AMP濃度確定，樣品中 AMP的峰面積必須落在不同濃
度的 AMP標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)只是一個(gè)參考。 
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