豬組胺（HIS）酶聯(lián)免疫（Elisa）試劑盒說明書

【資料簡介】

豬組胺(HIS)酶聯(lián)免疫（Elisa）試劑盒說明書試劑盒該試劑盒以 HRP 標記的鏈霉親和素復合物（HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）為基礎，可用于檢測細胞、組織內(nèi)的特異性 CD68 抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強定性定位準確、背景清晰。在所用的 CD68 一抗與相應靶抗原結合后，用生物化二抗與一抗特異性結合，zui后加入 HRP-SA，形成抗原—特異一抗—化二抗—HRP-SA 復合物，顯微鏡下觀察成像。

豬組胺(HIS)酶聯(lián)免疫（Elisa）試劑盒說明書試劑盒所含試劑：
試劑 A 通透液：0.1% Triton-X 100    10 mL（選用）
試劑 B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑 C （*分裝）已稀釋的即用型 CD68 一抗（2.5ml）
試劑 D （*分裝）化羊抗兔 IgG 1 支
（濃度 1.5 mg/mL，稀釋比為 1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液 20ml
試劑 E HRP-SA 復合物 1 支（濃度 1 μM，稀釋比 1:50~1:200）100 μL
試劑 F DAB 顯色液 5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲烷 1.21g
氯化鈉 7.6g
加蒸餾水 800mL，濃鹽酸調(diào) pH 值至 7.2~7.4，zui后定容至 1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復液）
10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸 0.38g
檸檬酸三鈉 2.45g
加蒸餾水 900mL，濃鹽酸調(diào) pH 值至 6.0，zui后定容至 1000mL
或：0.5M EDTA 修復液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉 2.45g
加蒸餾水 700mL，用 10mM NaOH 調(diào) pH 值至 8.0，zui后定容至 1000Ml
3.緩沖甘油封固劑 10 mL4.Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇 5min，95%乙醇 2 次（每次 2min），85%乙醇 2 min；75%乙醇 2min，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×2min；
4.抗原修復： 根據(jù)抗體說明書方法進行抗原修復，常采用高壓、微波（溫度達到 98~100℃）或酶消化修復法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復方法見附 1）* 注：有些抗原勿需修復，直接進入第 5 步封閉。
5.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 30 min；
6.加一抗：滴加用試劑 C（即用型一抗），37℃濕盒孵育 2 hr 或 4℃過夜；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的化二抗（試劑 D），37℃濕盒中孵育30 min；10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑 Tween 20，37℃濕盒孵育封閉 20 min；
12.加 HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑 E（1：50~200，終濃度 5~20 nM），37℃濕盒中孵育 30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用 DAB 溶液（試劑 F）顯色；
15.復染：自來水充分沖洗，復染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
豬組胺(HIS)酶聯(lián)免疫（Elisa）試劑盒說明書注意事項：
1.修復后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。
2.緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。
3.若試劑為微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4.封片前一定要換用 TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的 Tween 20，否則會影響結果觀察。
5.如須復染細胞核，則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。
附 1：
豬組胺(HIS)酶聯(lián)免疫（Elisa）試劑盒說明書抗原修復方法
常用抗原修復液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修復液（pH8.0 或9.0）等等。
一、酶消化修復法
切片脫蠟水化處理，TBS 沖洗，在組織上滴加或，37℃孵育20~30min 后 TBS 沖洗即可。
二、微波抗原修復法微波盒中加入抗原修復液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續(xù)微波 10~15min，取出微波盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調(diào)整。
三、直接高壓抗原修復法
取修復液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上，修復液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計時 1.5~2.5min 即可脫離熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。
四、隔水式高壓抗原修復法不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復液于微波爐中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計時4~8 min 即可關閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。