一、目的：

　　1、了解抗血清制備的基本過(guò)程：

　　2、掌握抗血清的收集和保存方法。

　　二、原理：

　　抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清，一般為動(dòng)物被人工注射某類抗原后制備的動(dòng)物血清。價(jià)的抗血清用于研究工作以及疾病的診斷和治療。

　　一種抗原能否引起抗體生成反應(yīng)，一方面取決于抗原分子表面有無(wú)抗原決定簇（Antigenic determinant），另一方面取決于機(jī)體的免疫狀態(tài)，當(dāng)具備以上兩個(gè)條件后，抗體生成將遵循抗體生成的一般規(guī)律——初次反應(yīng)和再次反應(yīng)。

　　抗原的種類繁多，包括天然的蛋白質(zhì)抗原和細(xì)胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫動(dòng)物具有不同的特殊性。一般*抗原免疫動(dòng)物需加用佐劑，尤其在使用可溶性抗原時(shí)，以期得到價(jià)的抗血清;合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物質(zhì)需先通過(guò)人工的方法與蛋白質(zhì)載體連接后再與佐劑混合免疫動(dòng)物，方可獲得理想的免疫效果。使用佐劑后可增加抗原的免疫原性和延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)存留的時(shí)間，從而改變了抗原原有的免疫原性。

　　三、材料：

　　1、金屬編號(hào)牌（對(duì)動(dòng)物作標(biāo)記錄）或染料;

　　2、1毫升，5毫升、20毫升注射器;

　　3、*頭（9#，12#），卡價(jià)苗針頭（41/2

　　# — 51/2

　　#）;

　　4、滅菌平皿，疫苗瓶，*瓶，皮塞以及吸管，脫脂棉;

　　5、卡介苗（75mg/ml）;

　　6、抗原（小鼠血清）;

　　7、*溶液，*溶液和5%葡萄糖溶液;

　　8、液體石臘（醫(yī)用），羊毛臘（配制佐劑用）;

　　9、滅菌生理鹽水，消毒用酒精，2.5%碘酒;

　　10、1.5%瓊脂，玻板，飯盒（保濕、保濕作用）;

　　11、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（家兔）。

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、動(dòng)物的選擇

　　羊、馬、雞、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)中，選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮抗原與動(dòng)物的種屬關(guān)系、抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動(dòng)物個(gè)體等因素。免疫用動(dòng)物應(yīng)選適齡、健壯.為雄性。zui常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是家兔，一般選擇選擇年齡在6個(gè)月以上當(dāng)年繁殖的♂性，體重2 ～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金屬編號(hào)牌固定兔耳，或用染料涂沫在動(dòng)物的背部，作出明確的標(biāo)記。

　　2、抗原制備

　　1）抗原稀釋：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml，于免疫前一天加入*溶液，使每毫升抗原溶液含*1000 UI，*1000 UI，放4℃過(guò)夜（一般可不加青、*）次日取出，與佐劑混合制成乳劑后用于動(dòng)物免疫。

　　免疫原的注射劑量應(yīng)考慮其抗原性的強(qiáng)弱、分子量大小、動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)和免疫時(shí)間。對(duì)于純的可溶性抗原的免疫劑量，通常小鼠抗原劑量為50～100μg/次，大鼠為100～200μg/次，兔為100μg ～1 mg/次，合成免疫原為2 mg（半抗原約為20～200μg），一般需要與等量的福氏*佐劑混合。加強(qiáng)免疫的劑量為計(jì)量的1/2，通常用不*福氏佐劑或不用佐劑。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法;反之，欲獲得價(jià)的抗血清，宜采用大劑量抗原長(zhǎng)程免疫法。

　　2）佐劑和抗原乳劑的配制

　　1佐劑的配制：福氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant），各實(shí)驗(yàn)室的配方不盡相同，我室采用的配方如下：

　　醫(yī)用液體石臘

　　20毫升

　　羊毛脂 12克

　　水浴溶化、混勻，分裝于*小瓶，用紗布、線繩扎緊瓶塞。8磅20分鐘滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。于免疫前?zhǔn)備抗原乳劑制備時(shí)，以活卡介苗（有時(shí)亦用死卡介苗）代替死結(jié)核菌，每毫升試劑中加入10mg活卡，即為福氏*佐劑。

　　2抗原乳劑的制備：其方法一般有兩種，其一，將等量的*佐劑（注意佐劑必須預(yù)先加熱融化，但不超過(guò)50℃）和抗原溶液分別吸入兩個(gè)5ml注射器內(nèi)，在兩個(gè)注射器的12# 針頭間套上一根長(zhǎng)約8～12cm的醫(yī)用無(wú)毒塑料管，將兩個(gè)注射器連接在一起（塑料管必須先經(jīng)酒精浸泡消毒，使用時(shí)取出，用滅菌生理鹽水沖洗后，與注射器針頭相連接，塑料管與針頭的口徑須合適，不能松，稍緊些為宜），針頭插進(jìn)塑料管約1～2cm然后由兩人相對(duì)而坐后緩緩?fù)苿?dòng)針蕊，使管內(nèi)溶液進(jìn)入塑料管道至對(duì)側(cè)注射器內(nèi)，每次推動(dòng)針蕊時(shí)必須把管內(nèi)容物全部推出，另一側(cè)也同樣操作，使管內(nèi)液體往返混合，直至形成油包水乳劑（Water-in-oil enulsion）為止。

　　其二是，將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內(nèi)，經(jīng)過(guò)反復(fù)碾磨，也可形成油包水乳劑，該法主要優(yōu)點(diǎn)是快速，可靠，不足方面主要是由于粘附過(guò)多，浪費(fèi)佐劑及抗原。

　　制成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果，因此，必須進(jìn)行質(zhì)量檢查，檢查的方法是將制成的乳劑滴一滴在涼水（自來(lái)水）表面，質(zhì)量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散，不合格者進(jìn)入水面后立即擴(kuò)散，水面油亦逐漸擴(kuò)大，這就必須要繼續(xù)操作至質(zhì)量合格為止。

　　但有時(shí)，由于佐劑的配制質(zhì)量原因，很難乳化至合格，遇有這種情況，須考慮重新配制佐劑。

　　3、免疫途徑，劑量和免疫周期

　　抗原注射途徑可根據(jù)不同抗原及試驗(yàn)要求，選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈或淋巴結(jié)內(nèi)等不同途徑注入抗原進(jìn)行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴結(jié)周圍、耳后等處皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時(shí)間多為2～4周。常規(guī)免疫方案為抗原加CFA皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫;再以免疫原加IFA作2～5次加強(qiáng)免疫，每次間隔2～3周，皮下或腹腔注射加強(qiáng)免疫。

　　1）常規(guī)（皮內(nèi)多點(diǎn)注射）免疫：

　　1*次免疫：劑量為每只兔子注射1.0 ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩只后腳掌的皮內(nèi)各注射0.2 ml，其余0.6 ml分多點(diǎn)注入脊柱二側(cè)，頸部，腹股溝和腋窩等處淋巴結(jié)附近部位皮內(nèi)，每點(diǎn)可注入0.05ml，分12點(diǎn)注入。

　　2第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不*佐劑。注射部位在腹部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注入0.1 ml。

　　3第三次免疫：再次免疫后兩周內(nèi)進(jìn)行，注射劑量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少許靜脈血，分離血清，試血測(cè)定效價(jià)。

　　2）淋巴結(jié)免疫：主要優(yōu)點(diǎn)是可減少抗原用量。過(guò)程如下：

　　1卡價(jià)苗致敏：免疫前足掌皮下每側(cè)各注入活卡價(jià)苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右觀察兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)，一般可腫脹如蠶豆大小，此時(shí)即可進(jìn)行淋巴結(jié)內(nèi)免疫注射。

　　2*次免疫：用手淋巴結(jié)后在兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)內(nèi)各注入抗原乳劑0.25ml，每只兔總量0.5 ml;為加強(qiáng)免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多點(diǎn)注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。

　　3二周后可如同*次免疫的劑量和途徑再注射一次，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價(jià)，效價(jià)如已達(dá)到要求可不必進(jìn)行第三次免疫。

　　有條件的情況下，免疫后要加強(qiáng)動(dòng)物飼料管理，如給熟黃豆飼養(yǎng)等。

　　3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用于細(xì)胞性或顆粒性抗原，而且抗原性較強(qiáng)者，例如用綿羊紅細(xì)胞免疫家兔或小鼠即可用此法。

　　4、試血，測(cè)定抗體效價(jià)

　　一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳靜脈或小鼠尾尖取少量血，分離出血清之后進(jìn)行試血。

　?、?環(huán)狀試驗(yàn)，較為經(jīng)典的方法，目前較少采用，如與20μg/ml以下的抗原于30 min內(nèi)能出現(xiàn)“艸”的沉淀環(huán)，即測(cè)定抗體效價(jià)達(dá)1：5000以上時(shí)為合格。

　　② 免疫雙擴(kuò)散法，這是zui常用的試血方法，其具體方法是，中間孔加稀釋的抗原（1mg/ml）10μl，周圍孔順時(shí)針?lè)较蚣又苽涞目寡宸謩e為1:2, 1:4, 1:8，1:16，1:32和1:64，（用生理鹽水或PBS稀釋）。經(jīng)37℃保溫24h后觀察結(jié)果，效價(jià)在1:16以上即可決定放血。

　　5、放血

　　經(jīng)效價(jià)檢查合格后即可放血。放血前動(dòng)物應(yīng)停食12 h，以減少血清中的脂肪含量。如擬保留該免疫動(dòng)物，可直接由心臟取血，或切開(kāi)耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血。取血后由靜脈緩緩注入等量5%葡萄溶液以補(bǔ)足失血量。取血的動(dòng)物經(jīng)2～3個(gè)月休息，可再次加強(qiáng)免疫后取血。如擬一次放血致死，可用頸動(dòng)脈放血的方法，各種取血方法如下。

　　1）心臟取血：固定動(dòng)物于仰臥位置，用食指探明心臟博動(dòng)量高部位（在胸骨左側(cè)，由下向上數(shù)第3與第4助骨之間，指兔），剪去少許毛，用2.5% 碘酒和75%酒精消毒后，以9#針頭在預(yù)定位置與胸部呈45。角刺入心臟，微微上下移動(dòng)針頭，待見(jiàn)血液進(jìn)入針筒后，即將注射器位置固定取血。2.5公斤體重的家兔一次可取血20～30ml。

　　2）耳緣靜脈滴血：先將耳緣靜脈附近的毛剪去用無(wú)菌棉球?qū)⑵つw擦干凈（不用酒精消毒，避免溶血）。用臺(tái)燈照射耳部使血管因溫度增高而擴(kuò)張，然后用無(wú)菌刀片將耳緣靜脈切一長(zhǎng)0.5cm的縱切口，*次切口應(yīng)從耳尖部開(kāi)始，以后再切時(shí)，逐步向耳根方向移動(dòng)。用無(wú)菌試管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不暢時(shí)，可用無(wú)菌棉棒輕輕將切口外血凝塊擦去（注意勿使切口損傷太大），血流仍可繼續(xù)流出，直至達(dá)到所需要的血量為止。取血后用無(wú)菌棉球壓迫切口止血。耳緣靜脈取血一次可取血50ml左右而動(dòng)物不死。

　　3）頸動(dòng)脈放血：使動(dòng)物仰臥固定四肢，頸部剪毛、消毒后縱向切開(kāi)前頸部皮膚長(zhǎng)約10cm，用*將皮膚分開(kāi)夾住，剝離皮下組織，露出肌層，用刀柄加以分離，即見(jiàn)搏動(dòng)的頸動(dòng)脈。小心將頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)剝離長(zhǎng)約5cm，選擇血管中段，用*夾住血管壁周圍的筋膜。遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈鉗夾住，用酒精棉花球消毒血管周圍，用無(wú)菌剪刀剪一V形缺口。取長(zhǎng)2.5cm、直徑為1.6mm塑料管一段，將一端剪成針頭樣斜面，并將此端插入頸動(dòng)脈中，另一端放入200ml無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，然后放開(kāi)*，血即流入三角瓶?jī)?nèi)，動(dòng)物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。

　　6、分離血清

　　必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，待收集于平皿或三角瓶?jī)?nèi)的血液凝固之后，用無(wú)菌滴管在無(wú)菌環(huán)境（例如超凈工作臺(tái)）中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過(guò)夜，使血清充分析出（不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血），經(jīng)離心沉淀分出血清，放進(jìn)低溫冰箱保存。使用前必須經(jīng)過(guò)簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

　　7、抗血清的保存

　　1）經(jīng)簽定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉，使其zui后濃度分別為0.01%或0.05%。

　　2）用無(wú)菌滴管將抗血清分裝小管，每管裝1ml左右。

　　3）-20℃以下保存，可保存2年以上。

　　4）如有條件可將血清冷凍干燥保存于4℃以下，保存時(shí)間更久

　　五、注意事項(xiàng)

　　1、動(dòng)物的免疫反應(yīng)存在著個(gè)體差異，甚至有人報(bào)告不同品種動(dòng)物一次免疫后產(chǎn)生的抗體的差別可高達(dá)500倍，所以制備抗血清時(shí)不能只免疫一只動(dòng)物，一般免疫3～4只，因?yàn)橛械膭?dòng)物可能產(chǎn)生抗體效價(jià)很低或不產(chǎn)生抗體，免疫反應(yīng)好的動(dòng)物所能提供的抗體往往高于一般動(dòng)物3～4倍。

　　2、為制備單價(jià)特異性高的抗血清，所用抗原純度越高越好，因此，在純化抗原過(guò)程中應(yīng)盡量除去可能存在的雜蛋白，這樣可以省去許多時(shí)間來(lái)吸收抗血清中的非特異性抗體。

　　3、要制備價(jià)的抗體，必須要加佐劑（一般采用*福氏佐劑），加佐劑后免疫動(dòng)物，抗體效價(jià)至少可增加5倍。但也應(yīng)考慮到，如果抗原中有微量的雜蛋白存在，即使0.005mg，亦可因有佐劑而產(chǎn)生非特異性的抗體，所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和抗原的純度適當(dāng)?shù)厥褂米魟?/p>

　　4、制成的抗原乳劑是否為油包水乳劑應(yīng)進(jìn)行檢查，否則會(huì)影響免疫效果，如不是油包水乳劑，應(yīng)重新制備。

　　5、當(dāng)抗原量過(guò)少不易提純時(shí)，可采用抗原抗體在瓊脂擴(kuò)散中形成的沉淀線直接免疫動(dòng)物制備抗體。

　　6、抗血清效價(jià)一般以抗血清稀釋倍數(shù)表示。血清效價(jià)的檢測(cè)方法很多，靈敏度各不同，因此在表示抗血清效價(jià)時(shí)，應(yīng)標(biāo)明檢測(cè)方法。另外，在沉淀反應(yīng)中，出現(xiàn)沉淀時(shí)的抗原、抗體比例有一較大的范圍，如用不同濃度的抗原測(cè)定效價(jià)時(shí)，結(jié)果會(huì)因此有別，所以在測(cè)定抗血清效價(jià)時(shí)，需注意抗原的濃度。

　　7、分裝保存的抗血清應(yīng)注明抗血清的名稱，效價(jià)，制備日期以及包裝量。