間接ELISA檢測鴨瘟病毒

①包被抗原的制備。取種毒適量，按2000u／ml加入雙抗，接種12日齡番鴨胚，接種量o，2ml／個，放人溫箱內孵化，逐日照胚，連續(xù)培養(yǎng)5天，收集接種后48—120h內死亡，胚體有典型病變的鴨胚尿囊液，8000r／min離心20min，取上清液，加入等量飽和硫酸銨，使其終濃度達50％飽和度，用玻棒攪拌均勻，置4℃過夜。次日把溶液混勻，10000r／min4℃離心30rain，沉淀用StolpH 7，4 PBS溶解，裝入透析袋內，用PBS透析。磁力攪拌器攪拌90min后置4℃過夜，期間換液4次。用10％BaCl2檢測透析液中有無SO42-，直至檢測不出SO42-為止。病毒液一20~C凍存?zhèn)溆?。用常?guī)方法處理SephadexG—200裝柱，取硫酸銨粗提的病毒樣品加在柱床上面，待病毒液全部進入柱床后用PBS洗脫，控制流速o．5mi／113．111，收集20管，每管5ml，722分光光度計測定各管的OD280和OD260值，依據公式蛋白濃度（mg／rnl）＝1．45 OD280一0．74OD260。計算各管的蛋白濃度，以蛋白濃度為縱坐標，試管號為橫坐標，繪制洗脫曲線，并計算每管的OD280／OD260，把比值大于1的各試管合并，用60％PEG-6000濃縮后再測定其蛋白濃度，作為包被抗原。

間接ELISA檢測鴨瘟病毒

②間接ELISA反應條件的選擇。

    酶標抗體工作濃度測定 參照文獻的方法提取健康鴨血清IgG，透析除鹽，再經SephadexG—25柱進一步除鹽，共收集lo管，于280nm波長處測各管的OD值，繪制洗脫峰曲線，取蛋白吸收峰高的幾管合并，分光光度計測其蛋白濃度。以o．05mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液將鴨IgG稀釋至100bg／mi，于酶標板的每孔中加入100／~L，置濕盒中4~C過夜。取出反應板，洗液（PBS—T，含0．05％tween 20的PBS洗滌3～5遍，拍干。加封閉液（含0．5％BSA的PBS-T），100iLL／孔，室溫作用2L，洗滌3—5遍，拍干。以稀釋液（含0，1％BSA的PBS-T）將酶標抗體作1：100、l：200、1：400、l；800等一系列稀釋，依次加入各小孔中，每個稀釋度加兩孔，每孔100t~L，室溫作用5h，洗滌。加底物溶液（OPI~Hz02，室溫避光20min，加入2mol／L H2SO：終止反應，50t~L／{L。490nm波長下測OD值，以能產生光密度為1．o的稀釋度為酶標抗體的zui適濃度。間接ELISA檢測鴨瘟病毒

抗原和血清稀釋度的選擇 采用方陣滴定法確定抗原和血清的工作濃度用0．05mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液將抗原作1：10、1；20、1：40、1：80、l：160、1：320稀釋，分別加入到酶標板的第1列至第12列，每個稀釋度加兩孔，每孔100／mL，37~C作用1h，轉入4~C過夜；次日洗滌后封閉，再洗滌；用含o．1％BSA的PBS—T將陰、陽血清作1：20、㈠40、1：80、1：60稀釋，陽性血清的4個稀釋度依次加入到酶標板的1行、3行、5行、7行，陰性血清的4個稀釋度依次加入到酶標板的2行、4行、6行、8行，每孔1001LL，置濕盒內37~C作用1h，再洗滌；加人1：400工作濃度的酶標抗體，37℃1h，洗滌；加底物溶液，室溫閉光30min；加終止液，490nm測其OD值。以尸／Nzui大者所對應的抗原和血清稀釋度作為抗原包被濃度和血清工作濃度。

    ELISA反應溫度和間隔時間的選擇 a，抗原吸附時間和溫度：抗原包被后分別以37~C 1h轉入4~C過夜和直接37~C 5h吸附，對8份血清進行間接ELISA檢測，測定OD值。b．封閉液封閉時間和溫度、血清反應時間和溫度、酶標抗體工作時間和溫度的確定均選擇37~C 1h，37~C 2h、室溫2h三種條件，對4份效價較高的血清樣品進行ELISA檢測，比較它們的OD值差異。c底物zui適作用時間的確定：以zui適稀釋度抗原、血清和酶標抗體進行試驗，加入底物后分別在室溫10min、20min、30rain終止反應，比較其OD值差異。陰陽性血清臨界值的確定 采集從1日齡飼養(yǎng)至28天，未作任何疫苗免疫的健康鴨血清30份，分別與等量鴨胚液混合，室溫作用2L，高速離心，取上清液作為陰性血清。測定30份血清的OD值，以OD平均值加上3個標準差作為判定臨界值，受檢血清高于此值即判為陽性。

③間接EIASA操作程序a．以zui適濃度的抗原包被反應板，100rtl／孔，37~C 1h轉人4~C過夜，次日洗板3—5次，每次5min，拍干。b．以含O．5％BSA的PBS—T封閉，37~Clh，洗板3—5次。c．加入zui適稀釋度的待檢血清，37~C 1h，洗板。d．加入zui適工作濃度的酶標抗體，37~C 1h，洗板。e．加入底物，室溫避光30min。f．加入終止液，50ul/孔 g．490nm波長下測OD值。