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谷an酸脫羧酶(GAD)試劑盒,微板法

谷an酸脫羧酶(GAD)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 谷*酸脫羧酶（GAD）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書 （貨號(hào)：WS2011W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 谷*酸脫羧酶 (GAD，EC 4.1.1.15)是一種吡哆醛類裂解酶，能專一的催化 L-谷*酸 裂解成為 γ-氨基丁酸 (GABA)和 CO2。GAD 廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中：哺乳動(dòng)物 體內(nèi) GAD 催化產(chǎn)生的 GABA 是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)；在植物中 GAD 的活性高 低可指示種子發(fā)芽能力和出苗率等。 本試劑盒利用*酚和次氯酸鈉比色法測(cè)定谷an酸脫羧酶（GAD）催化產(chǎn)生的 GABA， 最終生成藍(lán)色物質(zhì)，該物質(zhì)在 645nm 處有明顯光吸收，其顏色深淺與 GABA 含量呈正 比，進(jìn)而得出 GAD 活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 11mL 試劑二溶解備用， 試劑二 液體 22mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 4mL×2 瓶 B：液體 5mL×1 瓶 4℃保存 臨用前取 2mL 的 B 液進(jìn)一瓶 A 液 中，混勻后作為試劑六使用。混勻 后的試劑半個(gè)月內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該標(biāo)曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、谷an酸脫羧酶（GAD）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清液待用。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s， 重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、 上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 645nm，在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 100 100 試劑一 200 試劑二 200 混勻，40℃孵育 30min 試劑三 200 200本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，室溫 12000rpm，離心 3min，上清液待測(cè)。 ② 顯色反應(yīng)：在 96 孔板中依次加入： 上清液 80 80 試劑三 50 50 試劑四 10 10 試劑五 80 80 試劑六 80 80 混勻，20℃放置 20min，于 645nm 處讀取各管的 A 值， △A=A 對(duì)照-A 測(cè)定(每個(gè)樣本需做一個(gè)自身對(duì)照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加樣本質(zhì)量 W（如增至 0.2g），或延長(zhǎng) 40℃孵育時(shí)間 T（如增 至 1h 或更長(zhǎng)），或加大樣本量 V1（如增至 100μL，則試劑一和二相應(yīng)減少），或增加② 步中上清液體積（由 80μL 增至 130μL 則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的 W 和 T 和 V1 和 V3 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 4.3244x - 0.0017，x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量(μmol)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個(gè)酶活力單位。 GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103 =481.8×(ΔA+0.0017)÷Cpr 3、 按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個(gè)酶活力單位。 GAD(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103 =481.8×(ΔA+0.0017)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個(gè)酶活單位。 GAD(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.964×(△A+0.0017) 5、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個(gè)酶活力單位。 GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0017)÷4.3244]×(V2÷V3)÷V1÷T×103=481.8×(ΔA+0.0017) V---提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL； V2---反應(yīng)體系總體積，0.5mL； V3---第②步顯色階段上清液量，0.08mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30min； W---樣本質(zhì)量，g； 標(biāo)準(zhǔn)品 GABA 分子量---103.12； 500---細(xì)胞數(shù)量，萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向 EP 管中加入 2mL 蒸餾水；把母液稀釋成以下濃度梯度：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 2 按照顯色反應(yīng)階段的測(cè)定管加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。