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海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)試劑盒,微板法

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS2850W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 6-磷酸海藻糖酯酶（trehalose-6-phosphatephophatase，TPP，EC3.1.3.12）是海藻糖合 成的關(guān)鍵酶之一，催化海藻糖-6磷酸生成海藻糖。 本試劑盒利用 6-磷酸海藻糖酯酶催化底物 6-磷酸海藻糖生成海藻糖，海藻糖在海藻 糖酶的作用下分解成葡萄糖，接著在葡萄糖氧化酶作用下與特異顯色劑反應(yīng)生成有色物 質(zhì)，通過檢測(cè)該有色物質(zhì)在 520nm 處的值，即可得出的 6-磷酸海藻糖酯酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。用不完的試劑 分裝后-20℃保存，盡量不要反復(fù)凍融。 試劑三 液體 1mL ×1 支 -20℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑五 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱/金屬浴、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織樣本（水分足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰 浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌或真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或真菌加入 1mL 提取 液；冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），室溫晃動(dòng)提取 30min， 8000rpm 室溫（25℃）離心 10min，取上清。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液體積(mL) ：細(xì)菌或真菌數(shù)量（104個(gè)）為 1：500~1000 的比例提取 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本，可直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 520nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 20 20 試劑一 60 80 試劑二 20 混勻，37℃孵育 30min 后，立即沸水浴或金屬本試劑盒僅供科研使用 2 浴 5min 拿出。冷卻至室溫后再繼續(xù)添加試劑。 試劑三 10 10 混勻，37℃孵育 15min。室溫下于 12000rpm 離 心 10min，上清液待檢測(cè)。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 上步待測(cè)液 40 40 試劑四 10 10 試劑五 150 150 混勻，37℃避光孵育 20min，520nm 下讀取吸光值 A，△A=A 測(cè)定-A 對(duì)照(每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照)。 【注】1.若 A 測(cè)定大于 1.5，可對(duì)③步的上清液用蒸餾水稀釋，則稀釋倍數(shù) D 代入公式計(jì)算。 2.若△A 差值在零附近，可增加②步中樣本的體積 V1（如增至 40μL，則試劑一相應(yīng)減少）， 則改變后的 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y =0.1166x - 0.007；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為△A。 2、按照蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白在每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 TPP(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(V1×Cpr)÷T=2358.5×(ΔA+0.007) ÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 TPP(μg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(W×V1÷V)÷T=2358.5×(ΔA+0.007)÷W 4、按細(xì)菌或真菌密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或真菌每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 TPP(μg/h/104cell)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(500×V1÷V)÷T=4.72×(ΔA+0.007) 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 TPP(μg/h/mL)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷V1÷T=2358.5×(ΔA+0.007) V--提取液體積，1 mL；V1--樣本體積：0.02mL；W--樣本質(zhì)量，g；T--反應(yīng)時(shí)間，0.5 小時(shí)； 500--細(xì)菌或真菌數(shù)量，500 萬；0.11--第②歩反應(yīng)的總體積；0.04--第③歩反應(yīng)上清液體積； Cpr--樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：從標(biāo)準(zhǔn)品管中稱量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻 溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度：0, 0.04,0.08,0.12,0.16, 0.2mg/mL。 3 第③歩顯色反應(yīng)階段檢測(cè)：40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+10μL 試劑四+150μL 試劑五，37℃避光孵育 20min，520nm 下讀取吸光值 A。依據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。