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NAD+-山li醇脫氫酶(NAD+-SDH)試劑盒微板法

NAD+-山li醇脫氫酶(NAD+-SDH)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NAD+ -山*醇脫氫酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS9550W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 山*醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）催化山*醇脫氫生成果糖，是調(diào)控 生物體內(nèi)山*醇含量的關(guān)健酶之一，依據(jù)依賴的輔酶分為 NAD+依懶性山*醇脫氫酶 （NAD+ -SDH，EC 1.1.1.14）和 NADP+依懶性山*醇脫氫酶（NADP+ -SDH）， NAD+ -SDH 催化山*醇轉(zhuǎn)化成果糖，NADP+ -SDH 催化山*醇轉(zhuǎn)化成葡萄糖。 NAD+ -SDH 催化山*醇脫氫生成果糖，同時(shí)還原 NAD+生成 NADH，測(cè)定 340nm 吸光度增加速率可以計(jì)算 NAD+ -SDH 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、NAD+ -山*醇脫氫酶（NAD+ -SDH）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g 組織），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注意】 若樣本顏色較深（如植物葉片），可引起起始值 A1 值較大如超過(guò) 1.6，可在樣本制備過(guò)程中 增加除色素步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 80%乙醇冰浴勻漿，12000rpm， 4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復(fù) 2 次。最后向離心得到的沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液；超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測(cè)樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 3 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)；若渾濁離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 25℃,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 ② 所有試劑放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 20本試劑盒僅供科研使用 2 試劑一 10 試劑二 160 混勻，25℃下孵育 10min 試劑三 10 混勻，25℃下，20s 時(shí)于 340nm 處讀取 A1， 20min 后讀取 A2。ΔA=A2-A1。 【注】： 若ΔA 過(guò)小，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（如：40min 或更長(zhǎng)）再讀取 A2，或加大樣本體積 V1 （如增至 40μL，則試劑二相應(yīng)減少），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和加樣體積 V1 需代入 計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NAD+ -SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2. 按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NAD+ -SDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V) ÷T=160.8×ΔA÷W 3. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NAD+ -SDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.32×ΔA 4. 按照液體體積計(jì)算 酶活定義：每毫升液體每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NAD+ -SDH（nmol/min/mL）= [ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T=160.8×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02 mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； T---反應(yīng)時(shí)間，20 min； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)； W---樣本質(zhì)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。