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磷酸葡萄糖變位酶 (PGM)試劑盒,微板法

磷酸葡萄糖變位酶 (PGM)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 磷酸葡萄糖變位酶（PGM）試劑盒說明書 （貨號：WS3650W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 磷酸葡萄糖變位酶（PGM）在碳水化合物代謝中起關(guān)鍵作用，并廣泛存在于所有生物 體中。PGM 可使葡萄糖-1-磷酸（G1P）和葡萄糖-6-磷酸（G6P）互變。當(dāng)糖原分解時(shí)，PGM 將 G1P 轉(zhuǎn)化為 G6P，接著進(jìn)入糖酵解途徑產(chǎn)生 ATP，也可通過戊糖磷酸途徑產(chǎn)生核糖和 NADPH。相反，當(dāng)細(xì)胞需要能量時(shí)，PGM 將 G6P 轉(zhuǎn)化為 G1P，進(jìn)而產(chǎn)生糖原。PGM 的 缺乏可導(dǎo)致與葡萄糖存儲相關(guān)的疾病。 本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法：PGM 將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖 -6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶氧化形成 NADPH，接著與特異顯色劑反應(yīng) 生成有色物質(zhì)，通過檢測該有色物在 450nm 的增加速率，進(jìn)而計(jì)算出 PGM 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑三 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、磷酸葡萄糖變位酶（PGM）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 37℃,調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 試劑放在 37℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 150 混勻，37℃條件下孵育 10min 試劑五 10 混勻，37℃條件下，1min 時(shí)于 450nm 處讀取 吸光值 A1，11min 時(shí)讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】：1. 若ΔA 過小，可以延長反應(yīng)時(shí)間 T（如：21min 或更長）再讀取 A2，或增加樣本量 V1（如 增至 20μL，則試劑四相應(yīng)減小），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若 A2 值大于 1.5，可縮減反應(yīng)時(shí)間 T（如：6min 或更短）再讀取 A2，或減少樣本量 V1 （如減至 5μL，則試劑四相應(yīng)增加），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0838x - 0.0173，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量：nmol，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘使 1nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。 PGM（nmol/min /mg prot）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷ (V1×Cpr) ÷T=119.3×(ΔA+0.0173)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘使 1nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PGM（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(W×V1÷V) ÷T=119.3×(ΔA+0.0173)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義:每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘使 1nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活單位。 PGM（nmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(500×V1÷V)÷T=0.24×(△A+0.0173) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，10 min； Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. 0nmol/μL。也可根據(jù)實(shí) 際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。