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植物果糖-16二磷酸醛縮酶(FBA)試劑盒微板法

植物果糖-16二磷酸醛縮酶(FBA)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 植物果糖1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA） 試劑盒說明書 （貨號：WS3060W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 植物中的果糖 1,6- 二磷酸醛縮酶(Fructose-1,6-Bisphosphate Aldolase, FBA) 是卡爾文 循環(huán)(Calvin)中重要的酶，是控制光合作用速率的重要酶之一。在植物中有兩種在結(jié)構(gòu)上 有一定同源性的果糖 1, 6-二磷酸醛縮酶的異構(gòu)型,即葉綠體型和胞質(zhì)型。 FBA 可催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在酶促復(fù)合物的相繼 作用下催化 NADH 和磷酸二羥丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油，檢測 340nm 處 NADH 的下 降速率即可得出 FBA 活性的高低。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液一 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，每支加 0.3mL 蒸餾水溶解，用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 2.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、震蕩儀、低溫離心機(jī)、研缽。 四、植物果糖 1,6-二磷酸醛縮酶（FBA）活性測定： 1、樣本制備： ① 總FBA酶提?。?/span>建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液二進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃， 13000rpm離心5min，取上清液測定。 ② 胞漿和葉綠體 FBA 酶的分離： 稱取約0.2g樣本，加入1mL提取液一，快速冰浴勻漿后于4℃，1600rpm離心5min，棄沉 淀，取上清再4℃，5000rpm離心15min，取上清用于測定胞漿FBA酶活性，取沉淀加1mL 提取液二，強(qiáng)力渦旋震蕩15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm離心5min， 取上清測定葉綠體中FBA酶活性。提示：整個(gè)葉綠體的提取過程須保持4℃低溫環(huán)境。 建議測定總FBA酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 FBA，則按照步驟②提取粗酶液。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm，設(shè)定溫度 25℃。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 130 試劑五 20 輕輕混勻，室溫（25℃）條件下，于 340nm 處測 定，2min 時(shí)讀取 A1，15min 后讀取 A2， ΔA=A1-A2。 【注】1. 若△A 值在零附近，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間 T（如由 15min 增至 25min 后讀取 A2），或增 加樣本加樣體積 V1（如由 20μL 增至 60μL，則試劑四相應(yīng)減少），則改變后的 T 和 V1 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若下降趨勢不穩(wěn)定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來參與 計(jì)算，相對應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對會(huì) 偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于 檢測； 4. 若ΔA 值大于 0.5，需減少反應(yīng)時(shí)間 T（如由 15min 減至 5min 后讀取 A2），或減少樣本 加樣體積 V1（如由 20μL 減至 5μL，則試劑四相應(yīng)增加），則改變后的 T 和 V1 需代入 公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 FBA(nmol/min/mg prot)=[ ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=214.4×ΔA÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 FBA(nmol/min/g 鮮重)=[ ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=214.4×ΔA÷W ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4L； T---反應(yīng)時(shí)間，15 min； W---樣本質(zhì)量，g Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。