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測(cè)定意義：

AAT是一個(gè)多功能蛋白大家族，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種酰基化和去?；磻?yīng)，在基因表達(dá)、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙?；蕉〈?，同時(shí)還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測(cè)定412nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算AAT活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體25 mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管，-20℃保存。臨用前加蒸餾水1mL充分溶解，4℃保存。

試劑四：液體2 mL×1管，4℃保存。

試劑五：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入試劑二1mL充分溶解，4℃避光保存。

粗酶液提?。?/span>

稱取約0.1g樣品，加試劑一1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清液待測(cè)。

AAT測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零；水浴鍋35℃預(yù)熱。

2. 對(duì)照管：依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和10μL試劑五，20μL待測(cè)液，室溫放置10min后于412nm測(cè)定吸光度，記為A1。

3. 測(cè)定管：依次在500μL EP管中依次加入140μL試劑二、10μL試劑三、20μL試劑四和20μL待測(cè)液，35℃水浴15min，加10μL試劑五，室溫放置10min后于412nm測(cè)定吸光度，記為A2。△A測(cè)=A2-A1。

AAT活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

AAT活力單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個(gè)單位為1U。

AAT (U/mg prot) = 1000×△A測(cè)×V總÷(Cpr×V樣) ÷T= 666.7×△A測(cè)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

AAT活力單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.001個(gè)單位為1U。

AAT (U/g 鮮重) = 1000×△A測(cè)×V總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T= 666.7×△A測(cè)÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

AAT活力單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.0005個(gè)單位為1U。

AAT (U/mg prot) = 2000×△A測(cè)×V總÷(Cpr×V樣) ÷T=1333.4×△A測(cè)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

AAT活力單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.0005個(gè)單位為1U。

AAT (U/g 鮮重) = 2000×△A測(cè)×V總÷(V樣÷V樣總×W) ÷T= 1333.4×△A測(cè)÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min。

注意事項(xiàng)：

上清液蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。建議購(gòu)買本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。