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初級(jí)會(huì)員 | 第5年

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聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR)反應(yīng)一般過程

時(shí)間:2024/10/9閱讀:14
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PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR原理DNA雙鏈復(fù)制,DNA雙鏈結(jié)構(gòu)高溫氫鍵斷裂。目的是在生物體外大量擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),其特點(diǎn)是可以以微量的DNA為模板,快速擴(kuò)增得到大量拷貝。

PCR反應(yīng)過程:
1、變性:利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA解螺旋,高溫使兩條DNA鏈間的氫鍵斷裂。在第一個(gè)循環(huán)之前,通常加熱時(shí)間較長以確保模板DNA全分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,接下來機(jī)器就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
2、退火:將反應(yīng)溫度降低至50-65℃(通常比引物 值低3-5℃)持續(xù)20-40s,從而使引物結(jié)合于單鏈DNA上。若退火溫度過低,容易造成非特異擴(kuò)增,而退火溫度過高,引物可能根本不結(jié)合。
3、延伸:此步驟的溫度取決于所用的DNA聚合酶。 Taq(Thermus aquaticus)聚合酶的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳活性溫度約為75–80°C,但通常使用的延伸溫度為72°C。 在這一步驟中,DNA聚合酶通過從反應(yīng)體系中添加的5'至3'方向的游離dNTP,從而合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。延伸所需的精確時(shí)間取決于所用的DNA聚合酶和待擴(kuò)增的DNA片段的長度。 傳統(tǒng)的Taq 酶估計(jì)合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr 酶(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40s、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15s。有修正功能的則會(huì)比較慢。
上述循環(huán)結(jié)束后,將進(jìn)入終延伸階段:此步驟是可選的,但要在70-74°C)(PCR中使用的大多數(shù)聚合酶最佳活性所需的溫度范圍)下進(jìn)行5-15分鐘。
4、循環(huán):
以確保所有剩余的單鏈DNA的岡崎片段被補(bǔ)齊。
最終保持:最后一步將PCR儀反應(yīng)室無限期地冷卻至4–15°C,可用于PCR產(chǎn)物的短期保存。

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