實(shí)驗(yàn)原理：
是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法：
1、   血清-----操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2、   血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、   細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、   組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、   保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

標(biāo)本要求：
1. 血清：：溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
3. 尿液：無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。
ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：
①標(biāo)本因素；
②試劑因素；
③操作因素。
下面就一些常見(jiàn)ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析。
1．樣品稀釋 酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說(shuō)明書操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋，個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題。
2．試劑盒平衡 試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。 
3．樣品和試劑的混勻 稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。
下列是公司是正在的產(chǎn)品：

PACRG麻瘋病和帕金森氏病共同調(diào)節(jié)蛋白抗體Anti-SOX6antibody[155C5a]

PACAP-38腺苷環(huán)化酶激活肽-38抗體Anti-KDM5B/PLU1/Jarid1Bantibody

PACAP-27/38腺苷環(huán)化酶激活肽-27/38抗體Anti-WDFY3antibody

PACAPR1腺苷環(huán)化酶激活肽受體1抗體Anti-ALMS1antibody

PABP(MethylArg455/460)基化多聚腺苷結(jié)合蛋白抗體Anti-CalciumPumpPMCA4ATPaseantibody

PABP多聚腺苷結(jié)合蛋白抗體Anti-WDR58antibody

P95/NBS1DNA修復(fù)蛋白NBS1抗體Anti-Transmembraneprotein93/EMC6antibody

p95NBS1/Cellcycleregulatoryproteinp95細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白P95抗體Anti-dystrophiamyotonicacontainingWDrepeatmotifantibody

P73proteinP73腫瘤抑制基因抗體Anti-FilaminBantibody

p73alphap53相關(guān)蛋白P73α抗體Anti-IRS2antibody

p70S6KinaseBeta2/P70Beta2核糖體S6蛋白激酶β2抗體Anti-NRBF2antibody

p70S6kinasebeta核糖體蛋白S6激酶1抗體Anti-PAF1/PD2antibody

p70S6kinasealpha化核糖體p70S6蛋白激酶抗體Anti-TMEM16Aantibody

P63protein/P51AP63腫瘤抑制基因抗體Anti-AS3antibody

p58ipkp58ipk抗體Anti-TDO2/TDOantibody
PABA檢測(cè)試劑盒 MLC3F/MYL1/3肌球蛋白輕鏈1/3抗體Anti-Tat-SF1antibody

MKRN2/RNF62環(huán)指蛋白62抗體Anti-RAP1antibody

MKRN1/RNF61環(huán)指蛋白61抗體Anti-DDX6antibody

MKP-2/DUSP4絲裂原活化蛋白激酶酶-2抗體Anti-MST1/MST2antibody

MKLP1有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白樣1抗體Anti-GABAAReceptorgamma2/GABRG2antibody

Mkl1/MRTF-Amyocardin相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體Anti-PDE4Dantibody

MKKS/BBS6巴德-畢德氏綜合征蛋白BBS6抗體Anti-GlutathioneReductaseantibody

MKK7/ERK7絲裂原活化蛋白激酶MKK7抗體Anti-Adenovirusantibody(FITC)

MKK3/MEK3絲裂原活化蛋白激酶MKK3抗體Anti-OlfactoryMarkerProtein/OMPantibody

Miz1/ZNF60鋅指蛋白60抗體Anti-Cytomegalovirusantibody(HRP)

Mitofusin2/MFN2線粒體融合蛋白Mfn2抗體Anti-PCK1/PEPCantibody

Mitofilin/IMMT線粒體內(nèi)膜蛋白抗體Anti-CD146antibody

Mitoferrin1線粒體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抗體RecombinantE.coliCarbonicanhydrase2/CA2protein

MitochondrialribosomalproteinL11線粒體核糖體蛋白L11抗體RecombinantE.coliCarbonicanhydrase2/CA2protein

MitochondrialPyruvatedehydrogenasekinase1酮脫酶激酶1抗體RecombinantHumanLYVE1protein

測(cè)定步驟：

1.加樣
1. 除包被外都需45度加樣
2.加樣體積要準(zhǔn)確
3.管底加樣，不能加在管壁上
4.加樣時(shí)不能產(chǎn)生氣泡
2.溫浴
1.加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，應(yīng)立即放入按規(guī)定的反應(yīng)溫 度的水浴箱。
2.各ELISA板不應(yīng)疊在一起。
3.為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕 紗布的金屬濕盒中。
4.加入底物后，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。 如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便 不時(shí)觀察，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)。
3.洗滌
1.洗滌在ELISA過(guò)程中不是反應(yīng)步驟，但卻 是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。
2.目的是洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或 抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特 異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
4.讀板
1.陰性對(duì)照顏色極淺，在定性測(cè)定中一般 可采用目視比色。
2.如用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于 ELISA板底的平整與透明度、酶標(biāo)儀的質(zhì) 量和軟件的算法。