PCR特異性：

1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長(zhǎng)，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長(zhǎng)越好，太長(zhǎng)的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個(gè)BASE不要有GC，或者5個(gè)有3個(gè)不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯(cuò)配；
7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

產(chǎn)品名稱：普雷沃菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Prevotella spp.
貨號(hào)：XG01P3993
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
實(shí)時(shí)定量PCR：
①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽(yáng)性模板上游引物F  0.5μl
3  陽(yáng)性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽(yáng)性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

MEF, 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞宇佐美曲霉 Aspergillus usamii

苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti人少突膠質(zhì)細(xì)胞

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae蕈青霉 Penicillium paxilli

大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基BSA標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度試劑盒(即用型)-BSA

球擬圓酵母 Torulopsis globosa酸球菌 Lactococcus lactis

PLC/PRF/5(人肝亞力山大細(xì)胞)異常漢遜酵母 Hansenula anomala

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 Zymomonas mobilis釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

S180/小鼠腹水瘤人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

鼠李糖桿菌 Lactobacillus rhamnosus棒桿菌 Corynebacterium glutamicum

小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基人腺導(dǎo)管細(xì)胞

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae雅致放射毛霉 Actinomucor elegans

薛瓦酵母 Saccharomyces chevalieri小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

毛柄金錢菌(金針菇) Flammulina velutipes酸球菌亞種 Lactococcus lactis subsp. Lactis
普雷沃菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒人β淀粉樣蛋白40(Aβ40)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒5ku

標(biāo)準(zhǔn)品　CAS:00516　Benzyl Alcohol　進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)　　500mg

川續(xù)斷皂苷Ⅵ 訂購(gòu)|咨詢  20mg GA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子α/GABPα體 RNASE3 ELISA Kit 核糖核酶A3(RNASE3)ELISA試盒

人β淀粉樣蛋白42(Aβ42)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒 25mg

芐酯標(biāo)準(zhǔn)品　CAS:20514　Benzyl Benzoate　進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)　　5g

6羥香豆 質(zhì)量>98%(GC);進(jìn)分 6Hydroxycoumarin 檸檬串珠 Leuconostoc citreum燼灰鏈 Micromonospora cinereogriseus

人B細(xì)胞活化因子受體(BAFFR)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒  2.5ku

1芐35標(biāo)準(zhǔn)品

番茄紅  HPLC≥98%;20mg 訂購(gòu)|咨詢 雙(Dihydrotestosterone)ELISA試盒通用96T0.15610 ng/mL小鼠組織型纖溶酶原激活因子(tPA)ELISA試盒，tPA ELISA Kit

基因反應(yīng)體系：
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測(cè)樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。