PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

產(chǎn)品名稱：鮭魚立克次氏體探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Piscirickettsia salmonis
貨號：XG01P3966
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
實時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

Hela, 人宮頸細(xì)胞系洋蔥青霉 Penicillium alli

人結(jié)腸細(xì)胞桔橙小單孢菌 Micromonospora aurantiaca

小鼠成纖維細(xì)胞（EGFP標(biāo)記）A549(人非小細(xì)胞肺細(xì)胞)

費氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii人氣管上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeF81(貓腎細(xì)胞)

根瘤菌 Rhizobium sp.紅曲霉 Monascus anka

香菇 Lentinula edodes地衣芽孢桿菌 Bacillus licheniformis

大腸桿菌 Escherichia coli紫產(chǎn)色鏈霉菌直絲變種 Streptomyces Violochromogenes var. rectus

WM35, 人黑色素瘤細(xì)胞小鼠腎上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

NCI-N87 [N87]人胃細(xì)胞

小鼠皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（EGFP標(biāo)記）

費氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

唐菖蒲青霉 Penicillium gladioli
鮭魚立克次氏體探針法熒光定量PCR試劑盒人β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

58856932化學(xué)試鈣蛋白酶8(CAPN8)檢測試盒(酶免疫吸附試驗法)

佐克隆 質(zhì)量>98.5%,BP2009,BR Zopiclone Toll樣受體6(TLR6)重組蛋白英文名稱：Recombinant Toll Like Receptor 6 (TLR6)

人白介素32(IL32)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒219990701

58856932化學(xué)試封閉蛋白10(CLDN10)檢測試盒(酶免疫吸附試驗法)

山茶甙B  HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢 人絨膜生長(Choriomammotropin)ELISA試盒人96T0.31220 ng/mL小鼠β淀粉樣蛋白142(Aβ142)ELISA試盒，Aβ142 ELISA Kit

人腫瘤壞死因子受體超家族成員1A(TNFRSF1A)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒100片/盒 人肝脂酶 (LIPC)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒1g

58856932化學(xué)試封閉蛋白15(CLDN15)檢測試盒(酶免疫吸附試驗法)

反式茴香 訂購|咨詢  0.2ml G蛋白偶受體65體 MIP1β ELISA Kit 巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP1β)ELISA試盒

基因反應(yīng)體系：
序號  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。