PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補(bǔ)和二級結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

產(chǎn)品名稱：兔痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Rabbit Pox Virus(RPV)
貨號：XG01P4019
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
實(shí)時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

Poly-L-Lysine Solutiona(5mg/ml)規(guī)格：1mlgersion

小鼠胎兒表角質(zhì)形成層細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL

YT肉湯/YT BrothBR250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

C2C12(小鼠成肌細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

LM-137瓊脂/LM-137 Agar膜濾法單增李氏菌的選擇性分離250克國產(chǎn)/進(jìn)口

毛鼠肺成纖維樣細(xì)胞英文名稱：CWbRL

MG-63(人骨肉瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

1% NaC1蔗糖發(fā)酵管BR20支國產(chǎn)/進(jìn)口

大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL

D283 Med(人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

ACHN(人腎細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

麥角甾苷規(guī)格：20mg/支；98%
兔痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒RT4(人膀胱移行細(xì)胞瘤細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 T24(膀胱變移細(xì)胞癌)

NAALADL1 Others Mouse 小鼠 NAALADL1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照)

67979253T7 RNA Polymerase, HC25000 units豬瘟抗體(IgG)免疫試劑盒

CL0111HL7702(人肝正常細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

LLC小鼠Lewis肺癌細(xì)胞 LLC mice with Lewis lung cancer cells DMEM+10%FBS

520263SP6 RNA Polymerase2000 units豬胃泌調(diào)節(jié)素(OXM)免疫試劑盒

IgG2b Others Mouse 小鼠 IgG2bFc 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照)

IL12B Protein Mouse 重組小鼠 IL12B / IL12B 蛋白

520332SP6 RNA Polymerase, HC5000 units豬偽狂犬病毒(PRV)抗體(IgG)免疫試劑盒

基因反應(yīng)體系：
序號  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。