熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。

產(chǎn)品名稱(chēng)：路鄧葡萄球菌探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
英文名稱(chēng)：Staphylococcus lugdunensis
貨號(hào)：XG01P4106
分類(lèi)：熒光定量PCR試劑盒
儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門(mén)。

實(shí)時(shí)定量PCR：
①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋?zhuān)铀?7μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽(yáng)性模板上游引物F  0.5μl
3  陽(yáng)性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽(yáng)性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

基因反應(yīng)體系：
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測(cè)樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長(zhǎng)，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說(shuō)越長(zhǎng)越好，太長(zhǎng)的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個(gè)BASE不要有GC，或者5個(gè)有3個(gè)不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯(cuò)配；
7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

淡紫擬青霉 Paecilomyces lilacinus檸檬串珠菌 Leuconostoc citreum

雪白根霉厚垣孢普可尼亞菌 Pochonia chlamydosporia

293T(人胚腎細(xì)胞)日本根霉 Rhizopus japonicus

大麗輪枝菌 Verticillium dahliea Kleb人成纖維肉瘤細(xì)胞

根瘤菌球毛殼 Chaetomium globosum

負(fù)鼠腎細(xì)胞香菇 Lentinula edodes

豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

植物桿菌 Lactobacillus plantarum喜鹽芽胞桿菌 Halobacillus sp.

黑化大家鼠肺成纖維樣細(xì)胞綠色木霉 Trichoderma viride

小鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基ACCC40177 Nocardiopsis dassonvillei

大鼠腸上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基日本根霉 Rhizopus japonicus

NCI-H1703(人肺鱗細(xì)胞)MFC(小鼠胃細(xì)胞)

燕麥鐮刀菌 Gibberella avenacea球型芽孢桿菌 Bacillus sphaerious
路鄧葡萄球菌探針?lè)晒舛縋CR試劑盒4-甲酰

4-甲酰

1-芐基-3-乙氧羰基-4-啶鹽鹽

1-芐基-3-乙氧羰基-4-啶鹽鹽

6--1-茚

6--1-茚

6-溴-1-茚滿(mǎn)

6-溴-1-茚滿(mǎn)

1-十七烷醇

1-十七烷醇