豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vignaC6, 大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

786-O(人腎透細(xì)胞細(xì)胞)低分化胃

考馬斯亮藍(lán)G-250人少突膠質(zhì)細(xì)胞

宇佐美曲霉 Aspergillus usamii費(fèi)氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

A673(人橫紋肌瘤細(xì)胞)泡盛曲霉 Aspergillus awamori

NCI-H358(人非小細(xì)胞肺細(xì)胞)根瘤菌 Rhizobium sp.

植物桿菌 Lactobacillus plantarum色褐鏈霉菌 Streptomyces chromofuscus

A-375(人惡性黑色素瘤細(xì)胞)香菇 Lentinula edodes

草酸青霉 Penicillium oxalicumA549/DDP, 人肺腺耐藥細(xì)胞株

酸球菌亞種 Lactococcus lactis subsp. lactisInclusion body Denature Reagent/包涵體蛋白溶解液

MM, 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞小鼠神經(jīng)干細(xì)胞

解脂亞羅酵母 Yarrowia lipolytica費(fèi)氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae爪哇根霉 Rhizopus javanicus
福賽斯坦納菌探針法熒光定量PCR試劑盒2--4--3-甲基

2--4--3-甲基

2--4--3-甲

2-氟-4--5-甲基

2-氟-4--5-甲基

2-氟-4--5-甲基

乙氧甲?；谆交寤?/span>

乙氧甲酰基甲基三苯基溴化膦

乙氧甲?；谆交寤?/span>

六氟-2,4-戊鋁

實(shí)時(shí)定量PCR：
①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

基因反應(yīng)體系：
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長越好，太長的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個(gè)BASE不要有GC，或者5個(gè)有3個(gè)不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯(cuò)配；
7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vignaC6, 大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

786-O(人腎透細(xì)胞細(xì)胞)低分化胃

考馬斯亮藍(lán)G-250人少突膠質(zhì)細(xì)胞

宇佐美曲霉 Aspergillus usamii費(fèi)氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

A673(人橫紋肌瘤細(xì)胞)泡盛曲霉 Aspergillus awamori

NCI-H358(人非小細(xì)胞肺細(xì)胞)根瘤菌 Rhizobium sp.

植物桿菌 Lactobacillus plantarum色褐鏈霉菌 Streptomyces chromofuscus

A-375(人惡性黑色素瘤細(xì)胞)香菇 Lentinula edodes

草酸青霉 Penicillium oxalicumA549/DDP, 人肺腺耐藥細(xì)胞株

酸球菌亞種 Lactococcus lactis subsp. lactisInclusion body Denature Reagent/包涵體蛋白溶解液

MM, 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞小鼠神經(jīng)干細(xì)胞

解脂亞羅酵母 Yarrowia lipolytica費(fèi)氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae爪哇根霉 Rhizopus javanicus
福賽斯坦納菌探針法熒光定量PCR試劑盒2--4--3-甲基

2--4--3-甲基

2--4--3-甲

2-氟-4--5-甲基

2-氟-4--5-甲基

2-氟-4--5-甲基

乙氧甲酰基甲基三苯基溴化膦

乙氧甲?；谆交寤?/span>

乙氧甲酰基甲基三苯基溴化膦

六氟-2,4-戊鋁

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。