ssDNA/RNA環(huán)化連接酶

描述： ssDNA/RNA CircLigase 為熱穩(wěn)定的 DNA/RNA 連接 酶，不依賴(lài)于 ATP，可催化單鏈 DNA 或單鏈 RNA 的分子內(nèi) 環(huán)化。環(huán)化反應(yīng)中，要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基團(tuán)和 3’-OH 基團(tuán)。對(duì)于大于 15nt 的單鏈底物，該酶 都能高效的連接。 

組分

活性定義：65°C 1h 條件下，催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
底物環(huán)化，所需的酶量定義為 1Unit。
儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年。
反應(yīng)實(shí)例
1. 按以下組分配制反應(yīng)液
CircLigase (100 U/μl) 1 μl
5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
10×CircLigase Buffer 2 μl
50mM MnCl2 1 μl
ddH2O Up to 20 ul
65°C 孵育 1h 進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。
2. 失活反應(yīng)
反應(yīng)結(jié)束后，可加入終濃度 10mM EDTA 終止反應(yīng)。或采用
加熱方式 85℃ 10min 加熱失活。
使用注意事項(xiàng)：
(1) 環(huán)化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團(tuán)，3’端含有 OH。
(2) 環(huán)化體系中的 ATP 濃度高于 20μM 以上時(shí)會(huì)極大抑制環(huán)化效率，甚至導(dǎo)致環(huán)化失敗。因此建議底物為純化產(chǎn)物。
(3) 由于本酶提高了耐熱性，在 65℃條件下進(jìn)行連接反應(yīng)，在測(cè)試中 Betain 無(wú)益于連接效率提升。
(4) 本酶主要進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化連接，分子間的連接未檢測(cè)到。
(5) 本酶對(duì) ssDNA 和 RNA 的環(huán)化效率高，多數(shù)情況下，90%以上的底物被環(huán)化。未被環(huán)化的 ssDNA 可通過(guò)加入 5U的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以獲得高純度的環(huán)化 ssDNA。未環(huán)化的 ssRNA，將稍后給出去除方案。
(6) 本酶可以連接 15nt 以上的核苷酸，更長(zhǎng)的產(chǎn)物連接參數(shù)，將稍后給出測(cè)試報(bào)告及 protocol。
(7) 對(duì)于連接底物量較少的實(shí)驗(yàn)來(lái)講，推薦縮小體系，而不是減少酶的用量。在小體系實(shí)驗(yàn)時(shí)注意體系的蒸發(fā)，可加入礦物油以防止蒸發(fā)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。