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上海西格生物科技有限公司
初級(jí)會(huì)員 | 第5年

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5×Q-Solution

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更新時(shí)間:2024-05-21 14:39:22瀏覽次數(shù):96次

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一、模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;

二、引物:PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;

三、dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;

四、Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;

五、PCR buffer溶液:對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;

六、酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;


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①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí),要求RNA必須有Poly A,所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT,對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高,不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng),建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT,尤其適合模板豐度很低的情況(比如某個(gè)gene表達(dá)量很低)。選擇隨機(jī)引物時(shí),鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板,然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系,一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng,如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng,可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物(<500bp)的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物(GSP)是某個(gè)基因序列的一部分,與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合,每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此,當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí),則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同,所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物,建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

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