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武漢紐斯特生物科技有限公司
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更新時間：2024-04-23 16:17:06瀏覽次數(shù)：69次
聯(lián)系我時，請告知來自 環(huán)保在線產品說明小GTPases是細胞信號調節(jié)因子的一個超級家族
產品說明
小GTPases是細胞信號調節(jié)因子的一個超級家族。Ras屬于GTPases的Ras亞家族，調控細胞生長、細胞運動和基因轉錄。GTP結合增加了Ras的活性，而GTP水 解為GDP則使其失活。目前，Ras蛋白的激活是通過將GTP結合的Ras結合到Raf蛋白激酶的Ras結合域(RBD)來檢測的。這種方法是基于觀察到活性的，與GTP結合的 Ras可以與Raf的RBD結合。但該方法的重現(xiàn)性較差。這部分是由于在檢測過程中GTP相對快速地水解到GDP，并且RBD與Ras-GTP的結合親和力較低。
而武漢紐斯特生物技術有限公司推出的 N-Ras 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構象的 Ras GTP 結合蛋白而不識Ras GDP 結合蛋白(N-Ras)進而簡單并且快速的進行 Ras 的活性檢測。同時試劑盒中的 Ras GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中 Ras的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進行 30 次檢測
檢測原理
武漢紐斯特生物技術有限公司的K-Ras活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的Ras-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行GTPγS活化處理）活性Ras-GTP的水平(N-Ras),簡言之，特異性識別Ras活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的Ras-GTP活性蛋白(K-Ras)，然后利用 Protein A/G將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用Anti-NRas PAb進行免疫印跡分析進行檢測。
試劑盒組份及保存
試劑盒所需自備物品
1. 刺激和未刺激的細胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制劑；
3. 4 °C 搖桿或者搖床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 電泳和免疫印跡相關試劑；
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 檢測試劑；
實驗操作步驟
A 試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（）。
B 樣品處理
貼壁細胞
1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27?的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因 組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細胞
1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。
2. 計數(shù)細胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
5. 反復吹打細胞進行裂解。
6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，
將細胞裂解物用 27?的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）
注意：在細胞體內環(huán)境條件下大約有 10% 的 Ras 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Ras 被激活。
1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Ras 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
D. 激活 Ras 的親和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。
2. 向管中加入 1mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液。
3. 向管中加入 1ul 的活性 Ras 單克隆抗體。(Cat.# 26909)
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，
5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。
6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。
7. 5000g，離心 1 分鐘。
8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。
10. 次洗滌后，小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
12. 樣品煮沸 5min。
13. 5000g，離心 10s。
E. 蛋白印跡實驗
1.取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。
4. 將 PVDF 膜浸入 99%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。
5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。
6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-NRas PAb(Cat.# 21024),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 KRas 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.
8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。
10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。
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