鈣指示劑AM Esters的使用

1.帶有鈣指示劑AM酯：

     AM酯是非極性酯，很容易穿過活細胞膜，并被活細胞內(nèi)的細胞酯酶迅速水解。AM酯被廣泛用于wu創(chuàng)地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須特別注意，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）進行重構(gòu)。DMSO儲備溶液應在-20°C的干燥環(huán)境中保存，并避光。在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定數(shù)月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。該協(xié)議僅提供指南，應根據(jù)您的特定需求進行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯儲備溶液。

b）在實驗當天，將固體的鈣指示劑溶解在DMSO中，或?qū)⒌确值闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝亍Ｔ谀x擇的含0.04％Pluronic®F-127的緩沖液（例如Hanks and Hepes緩沖液）中，準備2至20 µM的工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。必須根據(jù)經(jīng)驗確定細胞加載所需指示劑的確切濃度。為避免因過載和潛在的染料毒性而導致的任何偽影，建議使用可以產(chǎn)生足夠信號強度的小探針濃度。

c）如果您的細胞（例如CHO細胞）中含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，則可以將丙*舒（2–5 mM）或亞砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（終孔濃度為1）丙*舒為-2.5 mM，亞磺酰吡嗪為0.1 -0.25 mM，以減少去酯化指示劑的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）添加到細胞板中。

e）在溫度或37°C下將染料加載板室孵育20分鐘（尤其是Fluo-8 AM）至2小時，然后在室溫下將板孵育30分鐘。

注1：降低加載溫度可能會減少指示器的分隔。

注2：將Cal-520 AM孵育2小時以上，對于某些細胞系會產(chǎn)生更好的信號強度。

f） 用HHBS或您選擇的緩沖液（包含陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如1 mM丙*舒，如果適用）替換染料工作溶液，以除去過量的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下運行實驗。

2.測量細胞內(nèi)鈣響應：

為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。

       解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準溶液相比，熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細胞環(huán)境中變化非常顯著。 細胞內(nèi)指標的原位反應校準通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進行原位校準。 或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。