適用儀器

樣本實驗方案

概述

1.在生長培養(yǎng)基中準備細胞
2.用測試化合物和Nitrite NOT工作溶液孵育細胞
3.添加分析緩沖液II
4.監(jiān)測Ex / Em = 650/680 nm的熒光強度

溶液配制

1.工作溶液

將20 µL Nitrixyte NIR儲備溶液（組分A）添加到10 mL的測定緩沖液I（組分B）中，并充分混合。 該工作溶液在室溫下穩(wěn)定至少2小時。 注意：20 µL Nitrixyte NIR儲備溶液足以裝滿一塊板,遠離光線。

樣品操作及實驗分析

1.要刺激內(nèi)源性NO，請在細胞培養(yǎng)基或所需的緩沖液（例如PBS或HHBS）中，用10 µL 10X測試化合物（96孔板）或5 µL 5X測試化合物（384孔板）處理細胞。對于對照孔（未處理的細胞），添加相應(yīng)量的培養(yǎng)基或化合物緩沖液。注意：添加化合物之前不必洗滌細胞。但是，如果測試的化合物對血清敏感，則可以在添加化合物之前將生長培養(yǎng)基和血清因子吸掉。加入90 µL /孔（96孔板）和20 µL /孔（384孔板）的1X Hank鹽溶液和20 mM Hepes緩沖液（HHBS）或抽吸后選擇的緩沖液?；蛘?，細胞可以在無血清培養(yǎng)基中生長。

2.在細胞板中加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Nitrixyte NIR工作溶液。將細胞與測試化合物和Nitrixyte NIR工作溶液在37°C下共同孵育一段時間，并避光。注意：請勿去除測試化合物。注意：對于NONOate陽性對照治療：將細胞與Nitrixyte NIR工作溶液在37°C下孵育30分鐘。除去工作溶液，并將細胞與1mM DEA / NONOate在37℃下進一步孵育30分鐘以產(chǎn)生一氧化氮。有關(guān)詳細信息，請參見圖1。我們在37°C的細胞培養(yǎng)基中使用Raw 264.7細胞與0.5X Nitrixyte NIR，20 µg / mL脂多糖（LPS）和1 mM L-精an酸（L-Arg）孵育16小時。有關(guān)詳細信息，請參見圖2。

3.除去每個孔中的溶液。加入測定緩沖液II（組分C），對于96孔板是100 µL /孔，對于384孔板是25 µL /孔。注意：在添加測定緩沖液II之前，請勿洗滌細胞。

4.使用酶標儀在Ex / Em = 650/680 nm（截止= 665 nm）下以底部讀取模式監(jiān)控熒光的增加，或使用帶有Cy5®濾光片的熒光顯微鏡拍攝圖像。