樣本實(shí)驗(yàn)方案

概述

1.準(zhǔn)備一氧化氮工作溶液（50 µL）
2.加入一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)液或測(cè)試樣品（50 µL）
3.在室溫下孵育30-60分鐘
4.監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 DAW-J2儲(chǔ)備溶液（200X）：
將25 mL DMSO加入小瓶DAW-J2（組分A）中，制成200X儲(chǔ)備溶液。

1.2 一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mM，未提供）：
我們使用DEA NONOate（Cayman Chemical，貨號(hào)82100，CAS＃372965-00-9）作為一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)。 一氧化氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.01N NaOH中的濃度為100 mM。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液

一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)
將10 µL 100 mM NONOate標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到990 uL分析緩沖液（組分B）中，以生成1 mM一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（SD7）。然后進(jìn)行1：2系列稀釋，以得到系列稀釋的一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)液（SD6-SD1）。注意：稀釋的NONOate標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)立即使用。

3.工作溶液

將25 µL DAW-J2 200X儲(chǔ)備溶液加入5 mL的測(cè)定緩沖液（組分B）中并充分混合。 注意：此一氧化氮工作溶液足以進(jìn)行100次測(cè)定。工作溶液不穩(wěn)定，請(qǐng)及時(shí)使用，并避免直接暴露在光線下。

樣品操作及實(shí)驗(yàn)分析

表1：黑色96孔微孔板中一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局。 SD =標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品

表2：每個(gè)孔的試劑組成

1.根據(jù)表1和表2提供的布局，將一氧化氮標(biāo)準(zhǔn)液（SD），空白對(duì)照（BL）和測(cè)試樣品（TS）制成黑色96孔微孔板。對(duì)于384孔板，請(qǐng)使用25 µL 每孔試劑，而不是每孔50 µL。

2.將50 µL一氧化氮工作溶液添加至標(biāo)準(zhǔn)液，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中，以使一氧化氮總測(cè)定體積為100 µL /孔。 對(duì)于384孔板，請(qǐng)?jiān)诿總€(gè)孔中使用25 µL工作溶液，總體積為50 µL /孔。

3.避光保存，室溫下孵育反應(yīng)30分鐘至1小時(shí)。

4.使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)= 570 nm，發(fā)射= 610 nm（截止= 590 nm）下監(jiān)控?zé)晒獾脑黾印?/span>