MycoLight 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)活細(xì)菌檢測(cè)試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)細(xì)菌的試劑盒，MycoLight流式細(xì)胞術(shù)活菌分析試劑盒提供了一種簡(jiǎn)便的方法，可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)酯酶活性評(píng)估細(xì)菌活力。 MycoLight™520是一種非熒光酯酶底物，可擴(kuò)散到革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌中。 通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解后，會(huì)產(chǎn)生綠色熒光產(chǎn)物，并在細(xì)菌內(nèi)積累。 與常用的酯酶底物CFDA和CFDA-AM相比，該試劑盒可提供更明亮，更穩(wěn)定的信號(hào)，具有更低的背景和更容易的染色方案。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的MycoLight 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)活細(xì)菌檢測(cè)試劑盒。

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.準(zhǔn)備100X染料儲(chǔ)備溶液。
2.準(zhǔn)備細(xì)菌樣品。
3.將細(xì)菌樣品與MycoLight 520在黑暗中于37°C孵育5-10分鐘或在室溫下孵育60分鐘。
4.通過(guò)帶有FITC通道的流式細(xì)胞儀分析樣品。

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1MycoLight 520儲(chǔ)備液（100X）：
將100 µL DMSO（組分C）加入一小瓶MycoLight 520（組分A）中，制成100X儲(chǔ)備液。

樣品示例及操作

1.準(zhǔn)備細(xì)菌樣品，濃度范圍為106到108個(gè)細(xì)胞/ ml。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中使細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)后期。通過(guò)以10,000 x g離心10分鐘除去培養(yǎng)基，然后將沉淀重新懸浮在測(cè)定緩沖液（組分B）中。注意：在波長(zhǎng)= 600 nm（OD600）處測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度，以確定細(xì)胞數(shù)。對(duì)于大腸桿菌培養(yǎng)，OD600 = 1.0等于8 x 108細(xì)胞/ ml。

2.根據(jù)需要用測(cè)試化合物處理細(xì)胞。通過(guò)以10,000 x g離心10分鐘來(lái)去除處理液，然后將沉淀物重新懸浮在適量的測(cè)定緩沖液（組分B）中，以使處理后樣品中的細(xì)菌濃度與活菌濃度相同。注意：開(kāi)始治療之前，請(qǐng)確定細(xì)菌培養(yǎng)物的濃度。注意：死細(xì)菌可以作為陰性對(duì)照，建議使用70％乙醇?xì)⑺兰?xì)菌30分鐘，然后煮沸60分鐘。

3.活/死細(xì)菌混合物制備示例：混合7種不同比例的細(xì)菌懸液，如表1所示，每個(gè)樣品的總體積為200 µL。

4.將2 µL 100X MycoLight 520儲(chǔ)備液加到200 µL Assay Buffer中的細(xì)菌樣品中。

5.充分混合并在黑暗中于37°C孵育5-10分鐘，或在室溫孵育60分鐘，以獲得染色效果。

6.在使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞之前，添加300 µL分析緩沖液（組分C）以增加體積。

7.用流式細(xì)胞儀通過(guò)FITC通道（488/530 nm）監(jiān)測(cè)細(xì)菌的熒光。注意：要排除雜物，建議將流式細(xì)胞儀的閾值設(shè)置為以下值：FSC> 10,000，SSC> 5,000。注意：MycoLight 520的效率高度依賴菌株，因此應(yīng)相應(yīng)優(yōu)化染色條件。

表1.混合以達(dá)到各種活/死比的活樣本和死樣本的示例體積