鼠抗人白細(xì)胞特異性單克隆抗體 Leukocyte Specific Protein  Western Blot技術(shù): 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡(jiǎn)寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），樣品不能反復(fù)凍融;，加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過(guò)程， 提高一抗?jié)舛取?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。
 鼠抗人白細(xì)胞特異性單克隆抗體 Leukocyte Specific Protein 如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)加上NaF去抑制磷#化酶的活性。
樣品的蛋白含量很低，每微升不到微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，可以加大上樣量，轉(zhuǎn)移時(shí)可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，多加5-0%甲醇。
想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋白不好做
如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30%是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試.5mm的 comb。
蛋白變性后存放-80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題，zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。
采用DAB顯色技術(shù)，二抗是化的多克隆抗體，三抗是親和素體系，不能使用脫脂奶粉，脫脂奶粉會(huì)影響親和素的生成，因?yàn)槊撝谭壑泻肂SA代替應(yīng)該好一點(diǎn).   Leukocyte Specific Protein   Western Blot一般上樣30-00微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。

一、 原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

二、分類  Leukocyte Specific Protein  現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用*種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

三、 主要試劑

、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?/font>（以利于溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。   Leukocyte Specific Protein 2 兔抗人突觸素多克隆抗體 Synaptophysin
LOP48 鼠抗人突觸素單克隆抗體 Synaptophysin（SY）
LOP482 兔抗人突觸素多克隆抗體 Synaptophysin（SY） #鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保存。

LOP483 鼠抗人Tau蛋白單克隆抗體 Tau Protein
LOP484 鼠抗人omerase（Catalytic Unit）單克隆抗體 omerase（Catalytic Unit）
LOP485 鼠抗人肌腱蛋白單克隆抗體 Tenascin（TN）
LOP486 兔抗人末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶多克隆抗體 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
LOP487 鼠抗人末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶單克隆抗體 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
LOP488 鼠抗人血小板反應(yīng)蛋白單克隆抗體 Thrombospondin（TSP）
LOP489 鼠抗人胸苷磷酸化酶單克隆抗體 Thymidine phosphorylase
LOP490 鼠抗人胸苷酸合成酶記單克隆抗體 Thymidylate Synthase/5-Fu Resistance Marker
LOP49 鼠抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體 Thyroglobulin（Tg）
LOP492 鼠兔抗人甲狀腺球蛋白多克隆抗體 Thyroglobulin（Tg）
LOP493 鼠抗人甲狀腺蛋白單克隆抗體 Thyroglobulin（Tg）
LOP494 兔抗人甲狀腺蛋白多克隆抗體 Thyroglobulin（Tg） 、 十二烷基硫

3、 分離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到00ml終體積。過(guò)濾后40℃保存。

4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(diào)至pH6.8加水稀釋到00ml終體積。過(guò)濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過(guò)硫#銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。0%（w/v）過(guò)硫#胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán).6ml，H2O 32ml混勻備用。按:或:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖液。臨用前稀釋0倍。

8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量L。

9、 麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S 2g 三#乙#30g 磺基水楊# 30g 加水至00ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋0倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。

0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒，戴手套操作），溶于磷#緩沖鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。

5、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶于00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。