Mag-Fura-2 AM, Cell Permeant 鎂離子熒光探針

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產(chǎn)品描述

Mag-Fura-2 AM是一種胞內(nèi)鎂離子指示劑，屬于紫外激發(fā)的比率型探針，與鎂離子結(jié)合的Kd值為1.9mM。與Fura-2類似，Mag-Fura-2的激發(fā)波長(zhǎng)歷經(jīng)藍(lán)色遷移從369nm到330nm。Mag-Fura-2 AM具細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單孵育，即可加載進(jìn)入細(xì)胞。

產(chǎn)品特性

1） CAS NO.：130100-20-8

2） 化學(xué)名：5-Oxazolecarboxylic acid, 2-[5-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethoxy]-6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy] -2-oxoethyl]amino]-2-benzofuranyl]-(acetyloxy)methyl ester

3） 同義名：Furaptra, AM ester

4） 分子式：C₃₀H₃₀N₂O₁₉

5） 分子量：722.56 g/mol

6） 外觀：黃色固體

7） 純度：≥90%

8） Ex/Em：336/503 nm

9） 溶解性：溶于DMSO

10） 化學(xué)結(jié)構(gòu)式：

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20oC干燥避光保存，至少一年有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 儲(chǔ)存液制備

取一管低溫保存的Mag-Fura-2 AM,，置于室溫回溫至少20min。之后加入高質(zhì)量無水DMSO配制成1~5mM儲(chǔ)存液，比如50μg Mag-Fura-2 AM（Mw：722.56 g/mol）溶于13.8μl DMSO，充分溶解后，即得到5mM儲(chǔ)存液。【注意】未使用的儲(chǔ)存液分裝儲(chǔ)存在-20℃，避免反復(fù)凍融，且要避光保存。盡快使用完。

2. 操作步驟

【注意】以下使用方法僅作參考，需根據(jù)具體的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求做出調(diào)整。加載溫度范圍是RT~37℃，更高溫度會(huì)提高加載速度，但更低溫度能小化染料的內(nèi)在化現(xiàn)象。表面活性劑Pluronic^® F-127有時(shí)加入能促進(jìn)AM探針在水溶性緩沖液內(nèi)的均勻分散。

2.1 在所需溫度（25℃~37℃）預(yù)孵育細(xì)胞10min，使其離子梯度達(dá)到穩(wěn)定和平衡。

2.2 取4μl Mag-Fura-2 AM儲(chǔ)存液和5μl 20% Pluronic^® F-127，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，劇烈漩渦混勻得到均勻的探針分散液。

2.3 取250μl上述制備的探針分散液加入750μl含細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)，混勻，此時(shí)得到終濃度為1~5μM的工作液，根據(jù)起始母液濃度來確定。

2.4 根據(jù)需求探針孵育15~60min。

2.5 細(xì)胞清洗3次，之后繼續(xù)孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)的探針*去酯化。之后選擇合適的儀器，進(jìn)行熒光測(cè)定。

3. 響應(yīng)校正

鎂離子指示劑的校正方法基本與鈣離子指示劑類似。需注意校正是在所有指示劑都已去酯化且都與離子結(jié)合的假設(shè)上進(jìn)行。校正包括*不含離子和離子*飽和相對(duì)于外部控制鎂離子濃度的熒光測(cè)定。胞內(nèi)校正可能以兩種方式進(jìn)行，要么通過去污劑裂解細(xì)胞（通常使用地膏辛）將胞內(nèi)指示劑釋放進(jìn)入周圍溶液，要么通過一種離子載體來控制胞內(nèi)鎂離子，不用釋放指示劑到周圍溶液。比率型指示劑比如Mag-Fura-2也可能在無細(xì)胞溶液內(nèi)進(jìn)行校正，雖然偏好選擇原位校正，由于指示劑對(duì)鎂離子的親和性依賴于胞漿環(huán)境。相對(duì)于離子霉素（MZ2151-1MG），鎂離子校正時(shí)傾向選擇離子載體A-23187（MZ2153-1MG）和4-bromo-A23187（MZ2154-1MG），由于前者能更有效的轉(zhuǎn)運(yùn)鎂離子。用來校正鎂離子指示劑的溶液初需不含重金屬離子比如鎂，否則會(huì)與鎂離子指示劑結(jié)合?？赏ㄟ^二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑TPEN（MX4529-25MG）處理溶液。

3.1 對(duì)于具離子依賴性的光譜遷移的指示劑，比如Mag-Fura-2，K_d值（或Mg²⁺濃度，當(dāng)Kd值已知）能通過以下公式進(jìn)行換算：

R：代表熒光比值（F_λ1/F_λ2），λ1是離子復(fù)合物的檢測(cè)波長(zhǎng)，λ2是游離指示劑的檢測(cè)波長(zhǎng)。Min和Max表示小和大離子濃度。Q：λ2波長(zhǎng)檢測(cè)下的F_min/F_max的比值。K_d是離子-指示劑復(fù)合物的解離常數(shù)。

3.2 對(duì)于單波長(zhǎng)指示劑比如Mag-Fluo-4，通過以下公式來確定K_d值，F指的是在單波長(zhǎng)下測(cè)定的熒光強(qiáng)度。

在上述公式中，需注意F值依賴于指示劑濃度，但R值不依賴于指示劑濃度。

相關(guān)產(chǎn)品

應(yīng)用示例（來自文獻(xiàn)，僅用作參考）

文獻(xiàn)一、Kolisek M et al. Mrs2p is an essential component of the major electrophoretic Mg2+ influx system in mitochondria. EMBO J. 2003 Mar 17;22(6):1235-44.

使用方法（熒光分光光度計(jì)測(cè)定[Mg²⁺]_m和 [Ca²⁺]_m）：1）用DMSO配制Mag-fura 2 AM（0.5mM）或Fura 2 AM (0.5mM)儲(chǔ)存液，工作濃度分別是5和10μM。2）線粒體分別加載Mag-fura 2 AM或Fura 2 AM測(cè)定游離線粒體內(nèi)的Mg²⁺或Ca²⁺濃度，[Mg²⁺]_m和 [Ca²⁺]_m。25℃，在SH緩沖液內(nèi)分別用Mag-fura 2 AM（5μM）或Fura 2 AM（10μM），和5ul Pluronic F-127孵育線粒體（0.5mg/ml），35min。之后用SH緩沖液清洗線粒體2次以去除多余探針。后，線粒體再孵育35min使得探針*水解。之后清洗兩次再開始熒光測(cè)定。

通過用熒光分光光度計(jì)測(cè)定探針加載線粒體的熒光值來確定離子濃度，大激發(fā)波長(zhǎng)分別為340和380nm，發(fā)射波長(zhǎng)為509nm。所有的測(cè)定在25℃進(jìn)行，3ml比色皿內(nèi)含2ml線粒體懸浮液（0.5mg 蛋白/ml）。

Fig 1. Original record of an Mg2+ measurement with yeast mitochondria and of the calibration procedure. Mag‐fura 2 emission at a wavelength of 510 nm was measured upon excitation at 380 and 340 nm (standard excitation wavelength for the free mag‐fura 2 and for the ion‐bound mag‐fura 2, respectively). (A) Single wavelength fluorescence intensities of mag‐fura 2‐loaded yeast mitochondria as a function of time and [Mg2+]e. Measurements were started with mag‐fura 2‐loaded mitochondria in essentially Mg2+‐free buffer (see Materials and methods). Mg2+ was added to final concentrations of 1, 5 and 10 mM. [Mg2+]e was raised to 25 mM before the addition of SDS, resulting in Rmax, and the addition of EDTA led to Rmin values. Inset: autofluorescence of mag‐fura 2‐unloaded mitochondria. (B) The 340/380 nm ratio of the fluorescence intensities shown in Figure 2A. Note that increases in the ratio are caused by an increase in the 340 nm intensity and a decrease in the 380 nm intensity, indicating that changes in the ratio are due in fact to alterations in the ratio of [Mg2+:mag‐fura 2]/[mag‐fura 2]. (C) Effect of an increase of the extramitochondrial [Ca2+] on the 340/380 nm ratio of the fluorescence intensities.

——Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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Mag-Fura-2 AM鎂離子熒光探針

Mag-Fura-2 AM鎂離子熒光探針